Story

使用双光子励磁激光扫描显微镜的活细胞中PA-GFP的4D Photactivation

我们报告了Aequorea Victoria绿色荧光蛋白的可光激活衍生物的两极激活(PA- GFP. )。当在413nm的高强度光照射后,这种特殊形式的分子增加了488nm的荧光强度。双光子拍摄产生了PA-分子切换的有效实际三维(3D)定位 GFP. 在明亮的状态。由于可以随时通过激光扫描系统时间致动磷,因此组合效果产生了对该过程的4D(X-Y-Z-T)控制。使用表达PA-的固定和活细胞进行实验 GFP. 通过对未激活的荧光蛋白的特异性吸附来改性其表面的荧光团和微球。分子开关在720nm至840nm的波长范围内被激活。传统的激活和双光子模式之间的比较显然阐述了更好的3D限制以及在特定蜂窝室内选择感兴趣的体积的可能性。这使得能够在高信号到噪声比下进行分子贩运研究。

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Introduction

绿色荧光蛋白( GFP. )来自Aukorea Victoria [1[其主题的多色变化是用于生物可视化的最常规的荧光示踪剂[2]。兴趣在细胞内蛋白质活性和运动的更精确定位研究,我们可以说,新的革命开始于去除术荧光蛋白的出现[3, 4]。蛋白质的荧光有效地带来了"new light"分子和细胞生物学研究[5, 6], 这"fluorescence toolbox" is growing [7]使用光学显微镜,朝向大分子级分辨率的步骤正在成为现实[8]。在这个关键方案中,我们专注于PA- GFP. 作为可光活化的荧光蛋白[3]以及由共聚焦和双光子显微镜提供的不可或缺的工具[9–11]。细胞内部的粒子跟踪很大程度上从空间和时间标记特定结构的能力遵循它们"signalling" over a "dark"背景是可能的,自PA-出现以来 GFP. 。 pa GFP. 在野生型中用组氨酸取代苏氨酸203的位点特异性诱变的结果 GFP. 。这导致优异的光可转换分子在405nm处的高能量通量照射后产生高达100倍的488nm励磁荧光,[3]。通过共聚焦显微镜选择性的选择性光激活立即证明了PA- GFP. 可以被认为是研究体内蛋白质的空间和时间动态的最佳工具,作为溶酶体和线粒体的跟踪[3, 4]。同时,当一个人使用pa-执行实验时 GFP. ,第一关键方面与执行光谱指纹识别的能力有关[ 12]。考虑到时,这特别有用"自发荧光分子海"存在于活细胞和组织中[13 ]。

现在,在光激活过程的空间限制方面,使用双光子甚至多光子励磁[14, 15[相比,提供了若干有利的方面,与单光子共聚焦显微镜在待跟踪的光鹧生物结构中[16–18]。由于非线性要求,子离心机的幅度级的高度狭窄的激励卷提供了对励磁的独特控制,并且因此在3D空间中的光激活。

即使单光子共聚焦激光扫描显微镜可以有效地调制平面亚微米区域中的激励功率,它也不能引起沿光轴的相同控制,是延伸到物镜的整个照明锥的激励体积[16]。通过光激活生物分子标记标记生物胚胎中的特定细胞的能力可以为理解细胞命运和分化机制提供一种独特的工具,以了解细胞命运和差异机制[17 ]。

材料和方法

共聚焦激光扫描显微镜
单个光子拍摄测量测量为徕卡进行 TCS. SP2共聚焦显微镜配有63×/ 1.40(油CS HC×PL apo. )物镜(Leica),雇用405 nm line of a 20 MWATT激光二极管。 Pa-的成像 GFP. 在488获得前后激活后 NM激光线。用于收集荧光的光谱窗口跨越500至600 纳米。使用的主要通道是通道2。

双光子励磁
Ti:蓝宝石激光源直接耦合到徕卡的扫描头中 TCS. SP2 a 共聚焦显微镜通过红外端口。使用平均力量收集测量<P>min = 2.5 mW up to <P>max = 12.5 用于两个光子诱导的光激活的焦平面的MW。使用488获得活化蛋白的成像 nm line of a 20 MW氩离子激光器。使用100x / 1.4收集图像(油HCX PL apo. ) 客观的。双光子激活过程遵循先前建立的步骤[16]:首先通过将脉冲红外激光束聚焦在样品的区域与λ的区域上首先突出 = 750 nm;随后,没有λ激发了一个没有放松的区域 = 488 nm and <P> = 0.04 MW(如物镜背面测量)以可视化活化的蛋白质。用于收集荧光的光谱窗口为500-600 nm, channel 2. a 和光谱单元用于在光活化过程之前和之后适当检查蛋白质发射光谱,图 1.

Samples

凤凰和Hela细胞在37次以标准培养条件生长 °C, 5 % CO2 在补充10的DMEM培养基中 %北美胎牛血清(Gibco Europe,Paisley,英国)。 pa GFP. 是乔治·帕特森博士的慷慨礼物。根据制造商说明,使用Fugene(Boehringer-Ingelheim Italia S.P.A.,米兰,意大利)试剂进行Hela瞬态转染。收获细胞并在48后固定 小时。在安装之前,用DNA染料Topro染色盖板 3(分子探测欧洲,莱顿,荷兰)促进细胞鉴定。用pa-转染凤凰细胞 GFP. 使用磷酸钙编码DNA。在24岁之后 小时,细胞在冷1x plc缓冲液中裂解(50 mM HEPES, 1.25 % glycerol, 150 mM NaCl, 166 mM MgCl2,1 % TRITONX-100, 0.001 % EGTA, 10 mM Napyruvate, 0.1 MM NaortovanAdate,0.01 MM PMSF,抑肽酶,胃蛋白酶和leapeptin)1 小时。将细胞裂解物与抗体一起温育 GFP. 多克隆抗体和随后用蛋白质是琼脂糖珠,用作幻影样品。对于成像,将珠子重新悬浮在90中 含有Diazabidclo-(2.2.2)辛烷溶解的%甘油溶液(Sigma-Aldrich S.L.L.,米兰,意大利)。修饰的球体夹在乙醇/丙酮清洁盖滑动和载玻片之间。为避免干燥,用普通指甲油密封样品[16 ]。

结果与讨论

类似于双光子激发的双光子激活,预计将是三维限制过程。这可以通过在含有PA-的人体样本中成像所选择的感兴趣体积来证明这一点 GFP. 或活细胞能够表达蛋白质。我们检查了光激活属性作为激活波长和功率的函数[16]使用PA-制作的幻影样本 GFP. 固定在珠子上。绿色荧光最初在488次兴奋 NM以可视化预激活强度。然后通过将脉冲红外激光束聚焦在22上的脉冲红外激光束来灌注激活过程 μm2 区域(512×512像素)。对于激活过程,每像素的停留时间在4.88之间变化 μs和几毫秒(ms)。随后,在激活过程之前使用的采集参数对未放大的区域进行成像。

图2显示了在用作幻影的PA-GFPSphere表面的不同条件下进行光激活的不同区域。分析激活之前和之后的图像以确定平均强度值。作为光电驱动的效率,作为光激活波长,图的功能,将活性区域的平均荧光强度的比例(c)作为光电转换过程的效率。 3.

由于局部限制的非线性励磁概率,预期有限厚度的激活体积是根据所提供的激光强度[14, 15[但是单光子诱导的活化应沿着样品中的光的整个光束路径延伸。单光子λ之间的比较 = 405 nm)和两光子激活过程如图所示 4.双光子活化体积的厚度限于电池内部的窄区域,而单光子激活导致轴向的完全活化的单元。

在核内的光活化体积的强度分布I(x,y,z)如图5所示。强度分布也是所使用的功率的函数。激活体积的变化基于基于强度分布I(Z)的变化,该强度分布I(Z)的变化作为逆第四动力律作为距离,Z的函数,来自镜头的几何焦点。使用像激发波长的参数,数值孔径,样品的折射率,可以根据焦平面的距离来预测任意强度值[16 ]。

光激活后发射的荧光的强度表示活性和未激活的体积之间的边缘,因此可以被认为是用于确定激活过程参数的阈值指示符。随着激光能量的函数,活化体积的厚度增加。可以使用以下数据三元组报告每个像素[μs],激活功率[MW]和FWHMI(Z)[μm]来概括不同体积的感兴趣的值。:(19.6,5,2.35); (4.9,17,3); (9.8,10,3.5)。

为了量化由于球体上的位置而导致的错误,在覆盖整个球体的不同区域,激活了相同的设置。 488辐射后荧光强度的差异 发现nm是10 %。测量强度值的这种不确定性是内在的,并且不会另外显示到统计错误。为了识别最佳工作效率,全激活频谱是有用的。通过我们的设置,720之间的波长范围 nm and 920 可以使用NM覆盖野生型的已知吸收横截面 GFP. 并且至少是EGFP的吸收峰。为了获取光谱,考虑了依赖于波长吸收两个光子的不同概率(用于更高波长的功率校正)。

测量激活过程的成功或效率荧光强度的比率(与L辐射 = 488 纳米)在双光子激活后和之前考虑过。发现转换效率在830以上的波长下降急剧下降 nm(对于高功率和长期来说,最重要的是)[16]。此外,效率显示出720之间的波长的高水平 nm and 750 nm. Up to 800 NM另一个效率水平适用。不幸的是,以下值显示出强烈的波动,既不明确分配给前一级,也不应在这一点上进行低级效率的转让,无需进一步调查。


图6:用徕卡获得光学切片细胞的投影 TCS. SP2 a 共聚焦显微镜:在紫色405nm低强度激励(未激活PA-) GFP. ),在绿色488 nm励磁(激活的PA- GFP. )WT-PA- GFP. 转染了HeLa细胞。第一行 - 并非所有激活;第二行 - 在非活化柱(紫色)中导致黑色矩形的部分之后,在光激活中亮绿色;第三行 - 后保存X-Z部分。

在目前的工作中,PA-的光物理性质 GFP. 已经概述了在多选激发的情况下,表明可以与蛋白质动态研究的光活化标记相结合使用双光子显微镜。 pa GFP. 在405时使用双光子励磁在光晕激励下,在远红色波长范围内发出相同的光电转换性能 NM:光子的吸收可以在488处诱导吸收横截面的增加 纳米。可以有效地将这种效果有效地用于标记整个细胞中的亚微米区域,以便通过情况,适当的兴趣体积。作为激发能量的函数检查激活的空间体积,显示强度调制可以有效地用于沿光轴诱导空间控制的蛋白质光电转换,提供一种动态地识别单个3D结构并考虑最终4D(X-Y-Z-T)过程的独特可能性。

可以有效地使用双光子活化来跟踪细胞周期步骤后活细胞中蛋白质和其他生物大分子的命运,并且还可以追求在3D存储器方面的应用。值得注意的是,偶联具有非线性过程的高分辨率水平的生物样品中蛋白质的选择性表达产生了一种用于科学固定的强大工具。此外,在光和蛋白质之间的相互作用中涉及的非线性过程的利用可以导致大分子分辨率水平,同时保持使用光学显微镜的优点[8,19,20 ]。


图7:用徕卡获得光学切片核的投影 TCS. SP2 a 共聚焦显微镜:在紫色405nm低强度激励(未激活PA-) GFP. ),在绿色488 nm励磁(激活的PA- GFP. )PA- GFP. 组蛋白H2B转染了HeLa细胞。

致谢

作者感谢George Patterson和Jennifer Lippincott-Schwartz for Pa- GFP. availability.

References

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