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SP8 FALCON:荧光寿命成像的新概念,可实现视频速率共聚焦FLIM

SP8 FALCON(FAst Lifetime CONtrast)是一种快速且完全集成的荧光寿命成像显微镜(电影)共聚焦平台。 SP8 FALCON提供视频速率 电影 借助基于快速电子设备和灵敏光谱混合检测器的荧光寿命测量新概念,可以实现逐像素量化。以标准共焦成像的典型计数率记录江苏体彩到达时间。该系统具有超短的死区时间和强大的内置算法,可进行数据采集和分析。深度整合 电影 进入共聚焦平台可轻松访问复杂的 电影 实验。

应用笔记 也可以在线获得 自然方法 or as pdf下载.

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共聚焦成像是生命科学中荧光成像的当前标准。功能成像超越了对分子种类的位置和浓度的传统记录,可以进一步研究分子功能:它们与其他生物分子的相互作用以及它们的活性,构象,分子环境和翻译后 修改。理想情况下,这必须以高时空分辨率完成。荧光寿命非常适合报告生物分子的功能状态,因为分子停留在激发态的时间高度取决于其环境以及与附近其他物质的相互作用[1,2]。由于寿命信息与荧光团浓度无关,因此它是功能成像的一种选择方法[3]。但是,有几个因素限制了该技术的广泛应用。 电影。首先,传统的与时间相关的单江苏体彩计数(TCSPC)解决方案本质上是缓慢且难以实现的,尤其是对于复杂的成像工作流程而言。因此, 电影 到目前为止,成像技术仅限于专业实验室,即使 专家了解,传统的TCSPC无法提供在数十秒以下的时间尺度上发生的生物过程的速度。

为了克服速度和实验复杂性方面的限制,我们开发了一种创新的概念来测量寿命(图1a)。的 电影 SP8的FALCON方法基于共聚焦扫描头,该共聚焦扫描头具有现场可编程门阵列(FPGA)电子器件,脉冲激光激发和快速的光谱单江苏体彩计数检测器。激光脉冲和江苏体彩的信号 每个检测器的到达脉冲都以非常高的速度数字化,其时间分辨率为97 ps。数据以比特流的形式被FPGA控制的模式识别算法分析。该步骤根据检测脉冲与激光脉冲到达时间之间的差来确定江苏体彩到达时间。通过测量从激光脉冲到检测器脉冲的时间差,可以避免抖动伪影。这些步骤直接在系统电子设备上执行,以确保最高速度并保持信号质量。然后将数据传输到计算机以生成图像,从总江苏体彩到达时间建立衰减曲线并计算荧光寿命。这些来自检测脉冲和激励脉冲之间到达时间差异的直接测量结果直接在线显示为“快速” 电影' 图片。
传统TCSPC的速度限制源于电子装置和/或检测器的死区时间长,使得该系统无法跟上现代共聚焦技术的典型江苏体彩通量。为避免由于所谓的堆积效应[4,5]而导致寿命被低估,传统的TCSPC系统在每个激光脉冲的江苏体彩通量介于0.01和0.1个江苏体彩之间运行[5,6],测量误差约为2.5% [7]。先前已经描述了纠正堆积效应的方法[4,8-12]。

SP8 FALCON实施了两种互补方法,这些方法可实现在高江苏体彩通量下进行寿命采集。第一种方法是组合多个检测器并将它们视为一个检测器(图1b)。由于SP8平台和SP8 FALCON电子设备具有完全的光谱灵活性,因此这是可能的。光谱的灵活性使得可以自由调节探测器的范围以覆盖单个发射光谱,并且电子设备可以将来自多个探测器的信息视为来自单个探测器。探测器的增加增加了江苏体彩通量,可以在采集之前或在分析步骤进行设置。实际上,SP8 FALCON保留信息 各个检测器比特流的组合,因此可以在任何时候一起或分别进行分析。这种多探测器方法以及整个系统死区时间低于1.5 ns,可实现精确的 电影 以每个脉冲1个江苏体彩的速率进行测量(图2e,详细信息请参见下文;与80 MHz脉冲激光器一起使用时,每个检测器可以达到80 Mcps)。第二种方法是实现高速 电影 江苏体彩滤波器可避免堆积效应。该滤波器确保忠实表示高江苏体彩通量下的整个寿命衰减。

除了高速 电影 滤波器,我们还采用了两种其他模式来评估数据质量(图2):“第一江苏体彩”滤波器和“所有江苏体彩”模式。 “第一江苏体彩”滤光片(图2a)专门根据每个脉冲后检测到的第一江苏体彩建立荧光衰减。该滤波器模仿了传统的TCSPC及其固有的堆积效应(图2b),从而导致寿命值的低估。在较高的计数率下,测得的寿命会人为减少[2](图2e)。 “所有江苏体彩”模式(图2a)会在检测到所有江苏体彩的情况下建立荧光衰减。尽管此选件具有显着增加江苏体彩统计量的优点,但它也会引入一些偏差,如果不加以纠正,则可能导致错误的寿命(图2e)。尽管如此,“全江苏体彩”方法仍可产生可测量的寿命,并且误差要小于传统的TCSPC。
使用高速 电影 滤波器(图2a),我们可以同时获得高江苏体彩统计量和准确的寿命值,同时误差最小(图2e)。使用此滤波器,我们确保仅将脉冲之间的单江苏体彩事件用于建立和拟合整体衰减。然后,SP8 FALCON电子器件和新颖的体系结构使我们可以直接使用Patting等人的总体模型和方程(等式1)。 [12]逐像素 电影 图像适合。这将导致:

用模型函数校正荧光衰减f(t);具有IRF,仪器响应功能; Ai,寿命分量的幅度; B,背景; P,激光脉冲数; τ,寿命;和td,停滞时间。

从高速获得准确的总体衰减曲线后 电影 过滤器,我们可以将适当的数学模型应用于逐像素计算。在每个像素处,我们使用未经过滤的数据来构建衰减和拟合的整体数学模型。

使用这种双重方法,我们可以确保使用最佳的拟合模型以及适当的江苏体彩统计数据(图2c)。这对于显示出具有非常不同的江苏体彩状态的子区域的样品特别有用。为了说明这一点,我们对EPAC cAMP表达非常可变的HeLa细胞进行了成像 电影 传感器13(图2d)。所有单元具有相等的cAMP水平,对应于约3.5 ns的测量寿命(图2d中的黄色像素)。 “第一江苏体彩”和“所有江苏体彩”过滤器在高江苏体彩通量下的表观寿命中显示出严重错误。高速 电影 滤波器捕获所有江苏体彩通量的准确寿命值,每个脉冲最多2.5个江苏体彩。
为了量化每个滤镜的效果,我们使用罗丹明B溶液在增加的激光功率下进行了寿命测量,每次衰变的最小计数为100万(图2e)。我们最初使用每个脉冲0.01个江苏体彩进行测量,并将其设置为参考寿命值。这些测量使我们可以直接看到计数率增加对寿命确定准确性的影响。我们注意到,使用“第一江苏体彩”滤镜,堆积效应在20–40时已经成为一个重要问题 Mcps。使用“所有江苏体彩”方法时,测得的寿命接近于参考值,但仍会产生较低的值。标准高速 电影 SP8 FALCON上的滤光片(图2e中的红色方块)可以在高达225 Mcps的江苏体彩状态下确定若丹明B的寿命,误差在0.2%至1.6%之间。数据显示SP8 FALCON显着增加
可用于可靠寿命测量的江苏体彩通量范围。
高速 电影 SP8 FALCON的记录对于进行严格的生物学实验至关重要。例如,它可以定时记录活患者来源的结直肠癌类器官14中的ERK活性(图3)。 ERK信号是大肠癌和其他几种癌症类型中恶性细胞生长的重要驱动力,使用改良版的EKAREV生物传感器15进行了记录。

总之,这  在共焦和多江苏体彩功能成像中发现的很少发现的速度性能,以及将生命周期成像无缝集成到所有基于强度的共焦成像和处理工具中,可以研究以前无法实现的生物过程。

视频1:实时3D 电影 在患者衍生的类器官上。使用ERK监测活体类器官中癌症衍生的信号转导活性的增加 烦恼-电影 生物传感器。功能信息显示 烦恼 ERK生物传感器的效率。更高 烦恼 效率表明较高的ERK活性。

视频2:使用SP8 FALCON快速钙振荡在视频速率下,观察到在组胺刺激下并装载了俄勒冈绿488 Bapta-1 AM的HeLa细胞中快速钙振荡。视频:由荷兰癌症研究所的Bras van den Broek的Kees Jalink提供。