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高分辨率共聚焦显微镜的BABB清算和成像:21世纪计数和抑制肾细胞

了解肾微方物是检测和识别肾病早期事件的关键。组织清除和成像的改善在该领域至关重要,现在我们报告了使用免疫荧光,光学清除,共聚焦显微镜和3D分析的组合来研究肾盂中的小型肾细胞耗尽的新颖,时间有效的方法。

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以前方法的限制

足细胞是肾脏肾小球过滤屏障的关键细胞组分1。然而,它们是终端分化的,因此不能在正常条件下完成成功的细胞分裂。结果,podocyte耗尽(每肾小球每肾小球的总数减少),是进步肾病发育的重要指标2。 Fococyte枯竭实际上,成为肾小球疾病的统一原理,迄今为止通过在组织学部分中每肾小球横截面计数Podocyte核来常规评估3。最近的研究已经强调了这种方法的局限性,包括低水平的准确性和精度,以及高度的生物变异性(特别是小鼠的研究)。

立体方法,“基于模型”和“基于设计的”(非偏见)的方法,产生从采样部分确定的泛键数数的估计。基于模型的方法需要核细胞核大小和形状的知识或假设。通常,假设这些值,并且在这些假设与真值不同的范围内,所获得的估计值偏置。用于估计多粒细胞数的基于设计的立体方法是非常耗时的,并且没有超过少数实验室采用。使用序列组织部分的Podocyte数估计的替代方法4 (“详尽的枚举”)非常繁琐且艰苦。

组织清除和光学切片的组合实现了新方法

幸运的是,新组织清除技术的出现5 结合光学切片,通过共聚焦,多光子或灯椎间镜显微镜可实现,现在不仅使令人遗憾的枚举不仅具有吸引力,而且对多茂细胞量化的显着改善,以及任何其他感兴趣的细胞,特别是那些在疾病的发展和进展中发挥中央作用的细胞。

我们采用这种方法,并开发了一种使用免疫荧光,光学清除,共聚焦显微镜和3D分析的组合研究泛细胞耗尽的新颖,时间效率的方法6。该技术已被用于量化在诱导诱导孔细胞中表达人白喉毒素(DT)受体的转基因小鼠的泛细胞耗竭的特征,其允许条件和剂量依赖性致统治死亡。

我们的定量形态学工具显着提高了对泛细胞耗尽的评估,并允许在肾皮层上研究全肾小球。可以检测单个肾脏在肾小球之间的植物细胞枯萎病的差异,在局灶性肾小球疾病的研究中提出了显着进展。

一种成像和定量泛细胞耗尽的新方法的研制

福尔马林固定的肾脏切成800μm的厚度,然后使用改性的免疫荧光方案对切片进行1小时抗原检索。通过将切片在琼脂糖中嵌入切片,然后通过甲醇的变化脱水,并通过几种苄醇,苯甲酸苄酯(BABB)的变化清除。

通过将脱水琼脂糖的边缘粘在玻璃培养皿中,我们将厚肾切片固定在盘底部,使标本均匀地成像 Leica TCS SP8 MP共用/多光子显微镜 配备专门的 徕卡20x / 0.95 na babb浸没目标。所使用的BABB混合物具有1.56的折射率,其也允许在需要时在倒置显微镜上进行更高分辨率的成像。

对于足细胞枚举,800μm厚的肾脏切片用阶段折叠成像,以便进入肾脏的完整横截面。这种促进对肾皮层的系统成像从肤浅到Juxtullullary地区,以产生无偏见的结果。也成像高达2mm的切片(表示该目标的完整工作距离),但通常使用800μm的部分,以1μm的间隔在2-3个通道上成像提供理想的分辨率,工作深度和总成像时间。


图3:肾盂的3D分析。 (顶部)用20x BABB目标(参见瓷砖视图的视频)拍摄的单个视野,显示多个Glomeruli,卷载后。 (左)共聚焦堆叠(强度投影)尽管单个肾小球。 (中间)体积呈现肾小球,(右)表面呈现,以允许Imaris中的体积计算。 DAPI标记的核也被成像(参见文章以进一步详细)。标签:SNP(绿色)和P57(红色)。

最终数据集提供可量化的podyyte微观结构进行分析,以及全面3D肾小球可视化。使用所有核(DAPI)的标记,泛细胞细胞质(Sybaptopodin,SNP)和胆细胞核(P57),以及Imaris(Bitplane Ag,Zürich,瑞士)的掩蔽和计数特征,可以确定分析的每个肾小球:( i)总泛骨细胞数(II)平均龟细胞体积,(iii)单个肾小球体积; 从那些数据计算(iv)泛细胞密度(每体积肾小球数量); (v)平均平节核体积; (vi)平均孔粒细胞细胞质体积。

虽然图像分析组件没有完全自动化,但需要手动监督,计数和分析明显更好,并且比到目前为止所有其他方法都更快。一旦获得共聚焦图像,就每肾小球约5分钟获得上述参数的值。

视频:3D体积呈现肾脏切片的肾小球。在大型组织切片中标记为SNP,约。 800微米厚度,逐步平铺成像。

讨论和前景

标本制备技术的进展和成像中的创新继续推动生命科学发现的发现界限。我们对组织微观结构和细胞和发育生物学的理解通过创新标记方法如灌注标记,改善荧光标记,以及荧光标记的可光稳定性以及组织清除技术,显着提高了显着提出。

我们现在具有前所未有的能力在细胞和亚细胞水平上研究整个生物体,整个器​​官和组织。这些技术适用于荧光宽场,灯椎板和共聚焦显微镜模型,所有这些都是由匹配BabB,清晰度和甘油的折射率相匹配的广泛的高NA,长工作距离目标。

此外,图像分析可用于有效地测量感兴趣的特征的数量,长度,表面积和体积。然而,许多当前挑战是这些随后的较大数据集的处理,分析和可视化,现在从GB迅速生长到TB尺寸。为快速发展的生物显影信息学学科开发更好的解决方案越来越重要。 

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