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发光的基本原理

自然界发生了很多发光过程。发光是那些发光不是高温结果的那些事件的伞术语。本文描绘了不同形式的发光,并在荧光的情况下详细进入细节。在制品的第二部分中解释了描述荧光染料,如猝灭,漂白或量子产率的相关技术术语,以详细了解荧光分子的基本特征。

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发光过程

一些非常常见的生物化学或生物化学实验室方法基于几个存在的存在"…escences"如磷光,化学发光,生物发光和最终荧光。作为对主题的介绍 荧光蛋白 学习有点可能很有用"…escences"。这些现象的起源位于拉丁文词中: -,这已经意味着与我们的视觉系统的连接。一切"…escences"描述我们可以用眼睛感知的物理,化学或生物过程。我们添加后缀"…escence"用词康复时表示改变,动作或过程的单词。

显然,荧光是我们可以看到的东西,涉及改变或过程的东西。我们将学习荧光如何在以后满足这些条件。首先,我们将简短看看另一个"…escences"这是所有的灯光本身.发光 是发射光的仿制术语,这不是高温的影响。因此,发光可以确定为寒冷的身体辐射的外观。该辐射可以是化学反应的一部分或晶体上的亚涂层运动或胁迫的原因。产生排放的另一种方法是 白炽 当物质作为热量发出的光线(例如热金属)。

化学发光 是基于化学反应的发光过程,其中产物具有激发中间体。该中间体在落入地面时发光。与荧光不同,化学发光材料中的电子通过化学反应激发,而不是通过光子的吸收。化学发光以例如轻棒中的技术应用。众所周知的化学发光物质是鲁米诺,其用于犯罪物质以找到血迹。这里的Fe.2+ 存在于血红蛋白函数中作为催化剂的离子,以将鲁米尔带到其发光配置。

如果生物体发出光明,我们会发言 生物发光,无论如何产生这种光线。有很多生物产生光,如萤火虫(骆驼耳菌)或萤火虫(Photinus Pyralis.)。在其他几个真菌的一行中非常非凡的生物是杰克奥兰特·蘑菇(omphalotus nidiformis.),在黑暗中发光。许多海洋生物如一些珊瑚,藻类,甲壳类动物或甚至鱿鱼都发光,主要是在蓝色或绿色光谱中。另一个海居民是生物糖粉的水母 Aequorea Victoria,来源 绿色荧光蛋白 ( GFP. )。而萤火虫,例如仅使用化学发光过程来产生光线, A.维多利亚 使用化学发光和荧光过程。由于科学家发现,水母在蛋白质的帮助下通过化学反应产生蓝光 aequorin. 。然后使用这种蓝光来激发已经提到的 GFP. 在荧光反应中导致绿色发光。

这使我们提出了这个问题:"什么是荧光?" 荧光 是一种过程,其中物质发光作为吸收较短波长的光的效果。打电话的波长差异 斯托克的转移。详细地,如果物质以光子形式吸收光,则会发生荧光。这导致电子转移到更高的能量水平。但这种高能量的情况是非常不稳定的,这就是为什么电子倾向于返回地面状态。在该过程中,能量再次以可被视为发光的光子形式释放。与磷光相比,电子能量移位非常快,实际上在纳米秒的范围内(图1)。任何能够在与另一个不同波长的激发后发射明显波长的物质的任何物质被称为a 荧光染料。这些是在下一节中讨论的。大多数本质上发生的荧光物质具有广泛的激发和发射光谱,但具有明确定义的激发和发射最大值的物质对荧光显微镜更有用。

类似于荧光, phosphorescence 是一种发光现象,其中磷光材料用光激发。尽管它与荧光密切相关,但它慢得多。与荧光相比,通过激发的电子能量与a的关联减速光子的重新排放"forbidden"状态。他们返回地面状态不会像荧光一样快地发生,因为能量是"trapped"。磷光材料的典型例子是"glow-in-the-dark"玩具可以用普通的灯泡或日光“充电”,然后发光几分钟甚至几小时。

Fluorochromes

如上所述,一个 荧光染料 是能够荧光的任何物质。在我们的情况下,荧光蛋白是荧光染料。在详细介绍之前,我们将介绍一些描述荧光蛋白的术语和表达。与荧光有关的通常使用的单词是荧光团:a 荧光团 是分子(例如蛋白质)的一部分,其负责其荧光的能力。所以 GFP. 或其衍生物是与之相关的任何杂种蛋白质的荧光团 GFP. 或其衍生物(例如α-小管蛋白 - GFP. )。但荧光团不一定是蛋白质。小分子喜欢 菲特 ,Tritc(20原子)或量子点(100-100,000原子)等也是荧光团。

看起来有点深入荧光团我们到达 发色团,这是定义其颜色的分子的一部分。在发色团内部,电子和互联的光发射的能级变换(见上文)。至少有两种形式的发色团。它们是由共轭π-电子共振系统( GFP. )或金属配合物(叶绿素,血红素)。

由于其对显微镜的相关性,我们将仔细看看发色团 GFP. 。事实证明,为形成的形成 GFP. 发色团没有其他辅助因子或酶组分比分子氧。由主要结构定义 GFP. 氨基酸骨架,它在自催化的折叠机构中自发地形成,通过分子内重排完成。详细说明,发色团是由三种相关氨基酸制成的。 Ser65, Tyr66Gly67 连续经历环化,脱水和氧化。这些反应的结果是一个 共轭π-电子谐振系统,成熟 GFP. 发色团。

看整个 GFP. 结构,循环三肽位于圆筒的中间。该气缸由形成β-筒结构的11股,使蛋白质具有高稳定性。 β-筒形结构的直径为约3nm,高度约为4nm。图3)。到目前为止已知的所有FPS具有这种保护圆筒,其对其光学性质具有很大影响。如果是 GFP. ,量子产率和光稳定性相对较高。此外,非常紧凑的蛋白质结构导致高pH抗性。标本与A. GFP. -TAG对温度相对较强,对如多甲甲醛,尿素或盐酸胍如多甲醛,尿素或胍丙啶等变性物质表达了高耐受性。

淬火和漂白

尽管如此,对于下一节中应提及的FPS存在某些限制和限制。这个过程 淬火, 例如,以可逆的方式降低荧光团的强度。这种衰减有各种原因。一方面,可能存在复杂的形成或内部转换。另一方面,淬火可以是能量转移过程的效果。称为显微镜应用 烦恼 利用此程序。在Förster-共振 - 能量 - 转移或荧光 - 共振 - 能量 - 转移供体荧光团D的能量转移到受体荧光团A中。D的荧光降低,而荧光增加。

与淬火是可逆过程的淬火,存在不可逆的荧光减少过程 。永久荧光损失基于荧光团的破坏通过长时间暴露于激发光。漂白量取决于光源的强度,曝光时间和能量。每种荧光团在漂白之前具有一定量的激发和发射循环。如果是 GFP. 每个分子都可以兴奋104–105 时代。这符合0.1-1秒。

使用共聚焦激光扫描显微镜光强度约为106 W/m2 是常见的。这种高能量剂量可使光子过量导致许多荧光分子在其激发状态的现象。在这种情况下,它们不再在其通常的波长下吸收光。 通过,有效的染料浓度减小或换句话说,在监视器上描绘的像素不再是染料浓度的直接函数。与用简单的弧灯的照明相比,使用高能激光可以导致发射和激发之间的非线性关系。

Quantum Yield

谈论荧光蛋白的效率,我们应该提及 量子产量。这是荧光团的另一个特征,比较光子输入和输出。对于一定荧光团的量子产率计算,发射的光子被吸收的光子除以所吸收的光子:

所以100 产率%,量子产率为1.用于激发的每个光子会在发射中产生一个光子。但是,这只是理论价值。在实践中,必须花更多的光子来激发比你进入发射的光。量子产量 GFP. 例如,0.6(见表1)。换句话说,在发射中获得6个光子,必须使用10个激励。

Brightness

亮度 在施加荧光显微镜时,荧光蛋白是考虑的另一个重要特征。根据显微镜的质量,该参数是实验成功的关键点。指定荧光蛋白亮度的客观方式是其摩尔消光系数的倍增,其量子产量除以1,000。物质的摩尔消光系数告诉我们一些关于其在不同波长的光的吸收。详细地,摩尔消光系数是通过摩尔浓度的物质在距离1的距离上吸光电磁辐射的尺寸 在不同波长的cm。因此相应的单位是m–1 cm–1.

借助该计算,可以比较不同荧光蛋白的亮度。如果我们采用摩尔消灭系数为56,000的eGFP的示例 M–1 厘米 –1 和量子产率为0.6,我们得到33.6的值 M–1 厘米 –1。有时人们谈论荧光蛋白的相对亮度。在这种情况下,通过将摩尔消光系数乘以量子产量和除以EGFP的亮度值来计算亮度(33.6 M–1 厘米 –1)。通过这样做,相对亮度转化为众所周知的EGFP,其能够稍微更快地比较不同的荧光蛋白。

Photostability

很多荧光显微镜实验都处理了活细胞的观察。采取特点,如淬火和漂白考虑,显然,生命细胞成像高度依赖于时间。即使在组织学或固定电池样本的情况下,也很重要,而不是照射你的标本过长的时间和太多的光强度。描述利益荧光蛋白抗蚀机制降解其荧光行为的能力的参数是光稳定性。 光稳定性 表示为通过的秒数,直到50 初始亮度的百分比消失了。为了比较,照明由一个最多10的弧灯提供 W/cm2,虽然高强度光源如激光(最多100 W/cm2)可能产生非线性效果。此外,为了测量和比较光稳定性,荧光蛋白样品的pH标准化为7.0,蛋白质溶液的液滴适应典型的哺乳动物细胞的尺寸。与上述光源相邻的照明是连续的。平行地,计数光子的发射。 在EGFP的情况下,需要174 秒是原始亮度的一半褪色(Shaner等人。 2005年)。换句话说,排放减少了1,000至500 光子/秒需要174 sec.

知道不同的特征,如激发和发射最大值,一定荧光染料或蛋白质的亮度,量子产量等,实验者能够选择不同的候选或观察条件,以满足他对某些实验设置的要求。此外,如果他知道不同荧光染料或蛋白质的照片物理特征,他能够以详细的方式解释结果。

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