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Beam Splitting

二向色镜和声光学艺术品AOBS

荧光显微镜通常采用入射光照明。相对于透射光荧光的优点是荧光信号和激发背景之间的对比度更好。从技术上讲,入射照明需要一种设备,该设备将照明用的光引导到样本中,并将样本发出的光同轴传输到检测系统。过去,各种类型的镜子是唯一的选择。如今,声光分束器最适合该任务。这是耦合白光激光源的唯一明智的解决方案。

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分光镜

为了将入射光束路径中的光馈入光轴,需要一种能够将照明同时引导到样品上并将发射光传递到检测器的设备。最简单的方法是反射例如50 透光率50 %。尽管这种安排可以完成任务,但是效率很低。浪费了一半的激发能,也浪费了一半的样品发射能量。由于光强度只是技术投资的问题,因此照明损失不是一个严重的问题。另一方面,荧光发射是珍贵的信号,应尽可能完全收集,损失50%是不可接受的。因此,可以使用具有更高比率的半透明反射镜。通常是80 % vs 20 接受%分割,这浪费了80%的激发光并收集了80%的激发光 排放的百分比。此外,有时还会讨论95/5分配器。

能量平衡的显着改善是彩色镜的引入。这些镜子具有易造成干扰效果的精细涂层。根据这些多层涂层的设计,可能会反射超过90 所需激发光(短波长)的百分比,并在90%以上的范围内透射 发射光的百分比(更长的波长)。这是典型的方法"dichromatic" or "dichroic"拆分镜像已实现。最简单的设计反射短波长并透射长波长。 50的位置 %反射和透射率用于表征二向色镜(例如"dichroic 580")。如果系统要适合一个以上的应用,则取决于荧光染料和合适的激发色,必须有一组不同的二向色镜。

经典的二向色镜不足以用于当代多参数荧光测量和记录。在此,通常同时应用2或3(或更多)种颜色,并且必须在激发带之间收集相应的发射。镜面技术仍然能够满足这些要求。复杂的镀膜协议允许生产具有交替反射带和透射带(带标签的双色,三色或四色二向色镜)的反射镜。

长期以来,该解决方案还是共聚焦荧光显微镜的常用方法。

图1左侧:入射光荧光束路径需要一个设备B,该设备B将从光源L发出的光馈送到样品S上。从样品发出的光必须通过同一设备才能被检测器记录D.这种设备称为"beam splitter"。 X和M分别是指激励滤波器和发射滤波器。右侧:二向色镜的透射/反射(长通版)。 50/50位置λo指定了此反射镜的特性。

声光束分束器AOBS

通过使用声光设备,可以实现完全不同的解决方案[1]。如有关AOTF的教程中所述[2],声光晶体可以被机械波“激发”。这种机械激励的结果是非常窄的光谱带发生偏转(范围为1 ... 3 nm)到另一个方向(1英石 阶)与非折射光束(0 命令)。我们如何使用此功能生成用于在入射光荧光光束路径中注入激发光的设备?

诀窍是在"reverse"模式。施加会偏转所需激发色的机械波(例如488 nm Ar-line),然后以不寻常的模式将该激光线馈入1英石 有序–并因此将沿着主方向离开晶体。然后,光必须穿过物镜并与样品相互作用。在此,产生荧光发射,然后由物镜收集。由于发射是斯托克斯位移的,因此发射将沿主方向行进通过声光晶体而无损失,因为发射与斯托克斯激光束相比具有不同的波长。然后将发射定向到检测器,该检测器通常是多通道(光谱)检测设备。

正如AOTF教程中指出的那样,声光设备易于编程以执行多行英石 同时偏转。为了 AOBS 为了达到目的,这立即提供了将激光线的各种组合同时馈送到样品上的功能。有了8个电子频道,就可以立即创建一个"octuple dichroic"设备–可以自由决定应使用哪种激光线组合。对于8行,可能有256种不同的组合。

AOBS可以做得更好

的发明 AOBS 解决了与镜子式分束器有关的许多问题。首先,零件没有机械运动。因此,不需要在轮子或滑块上进行复杂的镜面对准。而且,没有机械干扰可能会在扫描的图像上引起振动或其他机械影响。第三,与机械设备中的秒相比,重新编程在几秒的时间内完成。快速编程允许改进快速顺序扫描模式,例如照明方式的逐行变化,而不会因固定功能的反射镜而在发射侧造成损失。它还允许对每个区域具有专用分束性能的感兴趣区域照明和快速比率成像。

排放物的收集 AOBS 接近最大值。平均透射率约为96%,足够接近绝对最大值。注入激发光所需的带在几纳米的范围内。即使是在低角度操作中使用(镜面不以45°进给,而是以较小的角度进给的方法),使用镜面涂层也无法做到这一点。因此,声光分束器在光子收集方面的效率最佳。这始终是一个重要的要求,但在弱光应用,活体样品显微镜检查和类似情况下尤其有利。

作为 AOBS 是可编程的,可用于任何所需的波长或组合。不必设计一系列适合要求的组合的设备,实际上,它甚至可以为将来可能出现的新生产线的任何组合做好准备。如果研究人员的应用发生变化并需要其他激励方式,则无需修改二向色轮或滑块(通常需要服务工程师在现场工作)。只需单击鼠标,即可轻松获得所需的功能。 AOBS.

出于实际考虑,还应注意 AOBS 在调用激光线或可用激光线的任意组合后,软件会自动执行该命令。没有在发射路径中使用错误的分束器的风险,这可能会导致不必要的噪点图像或错误的光谱记录。

的灵活性 AOBS 是虚拟无限。可调性是无级的(通常通过数字控制1 可见光光谱400) … 800 纳米假设最小距离为10 到下一条激励线(甚至是一个非常保守的假设),以及1到8之间的任意数量的线的总和,可编程设计的数量都超过了百万标记。这是将白光激光源耦合到共聚焦显微镜中的前提条件。

AOBS二向色性45°二向色性低角度
切换速度10 μs≈1,000,000微秒≈1,000,000微秒
传输(峰值)96%,白色90%,颜色经过修改98%,变色
带隙(损耗)2–6 nm40–80纳米20–40纳米
同时带数844
灵活性(8条激光线)256≈ 8≈ 8
柔韧性(白光激光)› 100,000≈ 8≈ 8
最小距离‹ 105050
λ扫描白?是的
操作安全吗?是的


标签。 1:分束器的比较。显然, AOBS 是所有应用程序的选择方法。甚至透射率(在此处显示为整个光谱的峰值透射率)也非常保守96 %,现代的双色设置可能在本地具有更好的透射率(96的增益很小) % to 98 %). Still, the AOBS 没有固定的差距,就像任何二向色性一样。