Introduction
宽视野显微镜的特征在于整个标本的照明，并且与 共聚焦显微镜 只有一点点被照亮的地方它的变体，尤其是宽视野荧光显微镜，是生命科学中应用最广泛的技术之一。例如检测各种 荧光标记 固定或活着的标本中的蛋白可以提供对许多生物过程（如人类免疫系统）的洞察力。
人体在微生物入侵时会表现出先天性和适应性免疫反应。随着时间的流逝，适应性反应会产生高度特异性的反应，而先天性反应会立即对病原体上发现的特殊结构产生反应。它们被称为病原体相关分子模式（PAMP）。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌江苏体彩壁特有的，是这种模式的典型例子。 LPS与人类江苏体彩表面的一种特殊受体结合，即toll样受体4（TLR4）。 一旦结合，它可以触发江苏体彩内过程，最终产生称为江苏体彩因子的促炎蛋白（图1）。
江苏体彩内过程中的一个步骤是蛋白NF-κB从江苏体彩质转移到江苏体彩核中。 NF-κB作为转录因子发挥作用，支持相关江苏体彩因子基因的转录。此后产生的江苏体彩因子促使白江苏体彩（白江苏体彩）释放可以杀死细菌和病毒的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。不幸的是，ROS / RNS还会引起附带损害，并且可能对江苏体彩本身产生负面影响。受ROS / RNS损伤的组织江苏体彩释放出所谓的损伤相关分子模式（DAMP），它们本身可以触发TLR，从而再次启动整个过程并导致慢性炎症。这种自动放大的通行费样受体自由基循环（TLR自由基循环）可能与多种疾病有关，例如帕金森氏病，中风，抑郁症，（自身）免疫疾病或慢性阻塞性肺疾病（COPD）。一些 [1,2].
除了上述通过DAMP进行的内在活化外，还可能存在其他过程中产生的物质开始循环的可能性。例子是促炎江苏体彩因子，例如肿瘤坏死因子α（TNFα），ROS，例如H2O2 由进一步的江苏体彩过程产生，并产生自由基诱导辐射。
可以使用倒置研究显微镜来弄清炎症的分子过程。本文介绍了广角镜对我们团队的意义。最初，我们考虑购买共聚焦激光扫描显微镜。而是将宽视野荧光显微镜与 去卷积 之所以选择Google，是出于实际原因，例如，对于仅在有限时间段内加入该小组的学生来说，培训时间短。此外，宽视野荧光显微镜具有非常好的活江苏体彩成像能力，并施加了相对较低的光强度，从而降低了江苏体彩压力。
配备了各种荧光滤光镜立方体，专用物镜，快速滤光轮，气候控制和便捷的成像软件的宽视场显微镜可以为TLR自由基循环的许多方面提供照明。从普通的明场显微镜到免疫荧光实验，再到活江苏体彩和FURA成像，我们可以研究重要的现象，例如动物体内受影响组织的命运，LPS触发TLR4以及随后NF-κB易位至江苏体彩核和 2+ 炎症反应。
材料和方法
江苏体彩培养。 为了对NF-κB进行免疫荧光成像，使用了稳定转染了人TLR4，MD-2和CD14的HeLa江苏体彩。将江苏体彩在补充有10％的DMEM（Dulbecco的改良Eagle培养基）中培养 FCS （胎牛血清）和抗生素，根据制造商的说明。对于显微镜实验，将江苏体彩接种在玻璃盖玻片上，并在达到60-80％汇合时用于实验。
成像。 所有图像均拍摄于 徕卡DMi8倒置显微镜 与徕卡应用套件 X（LAS X）软件，配备用于组织样本的Leica DMC2900彩色相机和用于荧光成像的Hamamatsu Flash4 Cl sCMOS相机。为了进行活江苏体彩实验，将孵化室连接到提供5％CO的显微镜主体上2 和37°C。盲反卷积是通过嵌入在 LAS X成像软件。
NF-κB的免疫荧光动力学。 对于NF-κB易位测定，将接种在盖玻片上的江苏体彩用50 ng / mL LPS刺激60分钟。刺激后，将江苏体彩用PBS中的4％甲醛（1x；磷酸盐缓冲盐水；钙和镁； pH 7.0-7.2）固定。然后，使用一抗和Alexa Fluor568偶联的二抗对固定江苏体彩进行RelA（也称为p65）（NF-κB的亚基）染色。为了鉴定核区域，将江苏体彩用DAPI复染。为了可视化江苏体彩骨架，Alexa Fluor 488 Phalloidin用于染色肌动蛋白丝。将样品包埋在ProLong Gold抗褪色剂中，并使用Leica HC PL成像 APO CS2 63×/ 1.40油镜。
HeLa江苏体彩的瞬时转染 绿色荧光蛋白-RelA。 为了观察体内的NF-κB易位，将HeLa江苏体彩瞬时转染了 绿色荧光蛋白-RelA质粒使用电穿孔。 绿色荧光蛋白-RelA是Warner Greene的礼物（Addgene质粒＃23255） [3]。电穿孔后，将江苏体彩悬浮液转移至含有江苏体彩培养基的玻璃底皿中。转染后二十四小时，使用Leica HC PL在显微镜下检查江苏体彩 APO CS2 63×/ 1.40油镜和2×2相机装箱。用TNF-α（10 ng / mL）刺激江苏体彩后，每五分钟拍摄一次图像。
FURA成像。 对于钙测量，使用FURA-2AM（Sigma-Aldrich）。这种FURA-2衍生物（乙酰氧甲基）具有膜渗透性，能够进行比例实验。将HeLa江苏体彩与FURA-2AM（1μM）孵育30分钟。根据其钙的状态，FURA-2具有两个最大激发。含钙的FURA-2在340 nm处激发，游离的FURA-2在380 nm处激发。两种情况下的最大发射波长均为510 nm。对于比例实验，在340 nm和387 nm激发后测量荧光发射强度，方法是使用快速滤光轮进行。为了在340 nm处也获得最佳照明，使用了Leica HC PL FLUOTAR（340）20x / 0.80 OIL物镜，优化了低至340 nm的透射率。为了施加液体，使用了定制的微型分配器。图像采集和比率测量使用 LAS X软件。 FURA成像和活江苏体彩成像实验是在定制的塑料标本架的帮助下进行的，该标本架是为方便标本更换而生产的。可以将在圆形盖玻片上生长的江苏体彩拧入标本架的两半之间，并用液体覆盖（图2）。
组织学。 4周龄的C57BL / 6小鼠接受1.5％DSS（右旋糖酐硫酸钠）溶解于饮用水中10天。之后，处死动物，并收集部分结肠用于组织学检查。根据常规实验室方法，处理结肠样品并将其与组织包埋中心Leica EG1150一起包埋在石蜡中。使用Leica RM2255切片机和Leica HI1210水浴将石蜡块切成4μm薄片。然后，将切片置于显微镜载玻片上，并使用标准方案用苏木精和曙红（HE）染色。
HE切片在显微镜下用Leica HC PL Fluotar 20×/ 0.80油物镜检查。根据样本量，对每张幻灯片的对照成像10次单块扫描，对DSS处理的小鼠进行21次单块扫描，然后使用 LAS X软件。图7分别显示了2×2图像的摘录。所有动物实验均在美因兹大学转化免疫研究所的Schuppan博士实验室进行。根据德国和欧盟的法规，包括执行欧洲理事会指令2010/63 / EU的德国动物福利法，对小鼠进行饲养，处死和处死。
Results
LPS刺激后，NF-κB易位至核。 炎症是由信号级联触发的过程，该信号级联始于模式识别受体（PRR）的激活（图1）。这些PRR之一是收费型受体4（TLR4）。在LPS结合后，TLR4复合物诱导江苏体彩内信号网络，最终激活转录因子NF-κB。转录因子然后从江苏体彩质转移到江苏体彩核，并促进促炎性江苏体彩因子的表达 [4].
NF-κB易位至江苏体彩核的过程可以用荧光显微镜研究。为此，将稳定转染了TLR4构建体的HeLa江苏体彩暴露于LPS 60分钟。固定后，对RelA（NF-κB的亚基）进行了免疫染色。作为对照，还标记了未刺激的江苏体彩。
在未刺激的江苏体彩中，NF-κB（品红色）主要位于江苏体彩质中（图3）。用LPS刺激60分钟后，NF-κB易位进入江苏体彩核。通过一个江苏体彩绘制NF-κB的强度分布图，可以确认非刺激江苏体彩中最高量的NF-κB可以在江苏体彩核周围成像。尽管如此，在江苏体彩核内仍可检测到较低的NF-κB信号，这可能是由于来自江苏体彩核上方和下方的NF-κB分子发出的聚焦光所致。用共聚焦显微镜获取薄的光学切片可以减少这种情况的发生。
反卷积是避免因散焦而产生的误解的另一种选择。宽视场显微镜不仅可以检测聚焦平面中的光，而且还可以检测例如来自其他区域的散射光。解卷积软件算法可以帮助将荧光信号重定向到其起源。图4显示了这种方法。用荧光显微镜对免疫染色的HeLa江苏体彩进行成像，然后进行反卷积，该成像已集成在成像软件中。与原始图像相比，经反卷积的图像显示了更清晰的细节，同时仍保留了定量数据。因此，可以更精确地确定NF-κB分子的位置。
可以想象通过在孵育后的不同时间固定江苏体彩并测量江苏体彩核与江苏体彩质之间NF-κB的比例，将这些基于荧光显微镜的图像用作转运测定法。例如，在这种测定中，可以测试抗炎成分。可以将潜在的物质添加到江苏体彩培养物中，并且可以直接观察其对NF-κB易位的影响。与其他基于筛选的方法相比，这将在单江苏体彩水平上提供信息。
通过用荧光标记的蛋白质转染江苏体彩，感兴趣的蛋白质的动力学也可以通过活江苏体彩成像检测。为此，将HeLa江苏体彩用NF-κB亚基RelA-绿色荧光蛋白。除脂多糖外，还有其他刺激可引起NF-κB易位进入江苏体彩核。其中之一是TNFα。因此，在活江苏体彩成像之前，已用TNFα处理了转染的HeLa江苏体彩（图5；可在此网址上以本期数字版本在线观看视频： http://dx.doi.org/10.1017/ S1551929516000894）。
可以看到，TNFα刺激后，江苏体彩核中的NF-κB浓度大大增加。 20分钟后，大多数转录因子已经转移。有趣的是，在达到此峰值后，NF-κB开始重新定位到江苏体彩质中。
建立上述荧光显微镜测定法以使用NF-κB作为炎症指示剂。它们可用于测试江苏体彩培养系统中的促炎物质，尤其是抗炎物质。这可能会发现潜在的慢性炎症治疗方法。
炎症过程中的电信号传递。 炎症反应与江苏体彩内和江苏体彩间电信号传导相关。离子通道与炎症高度相关，其表达和功能可能受LPS影响 [5,6] 或江苏体彩和趋化因子 [7]。因此，除了上面提到的NF-κB易位测定外，测量离子信号还可以洞察促炎症刺激和消炎刺激的功效。通过量化江苏体彩内钙，钠和钾离子的浓度变化，人们可以研究刺激炎症的物质以及如何中断这一过程。
江苏体彩内钙浓度可以使用荧光钙间接成像2+ 指标。通常，离子敏感性荧光染料可逆地与特定离子结合，并在结合后改变其荧光特性。其中之一是FURA-2，它属于“双重激发离子指示剂”。
根据其结合状态，它改变其最大激发。钙2+ 未结合形式在380 nm处激发，并且Ca2+ 340nm处的结合形式。通过测量510 nm处的荧光强度比，可以得出Ca2+ 响应。使用比率度量规避与FURA-2浓度或江苏体彩厚度的局部差异有关的不精确性 [8].
为了在我们的实验室中建立比例成像的方法，为HeLa江苏体彩建立了协议以及包括定制微分配器的特殊硬件设置。使用易于获得的ATP刺激而不是炎症的例子，可以首次测量江苏体彩的电反应。在这里，ATP被用来引起江苏体彩表面普遍表达的P2Y受体完成的典型生理反应。该嘌呤能受体触发钙从内质网（ER）流出进入胞质溶胶，然后可以被FURA-2检测到。图6显示了上述比例实验。
加入ATP后，负载钙的FURA-2（例如340 nm）的荧光强度增加，而同时不含钙的FURA-2（例如387 nm）的荧光强度降低。刺激后约100秒，钙被转运回ER，FURA-2荧光活性处于原始状态。
通过比例成像的选择，可以研究钙在炎症过程中的作用并将其分别用作炎症的指标。例如，可以用这种模型检查局部麻醉剂的抗炎能力。
在荧光显微镜下观察活江苏体彩需要特殊的成分，以使其保持生命并处于接近自然的条件下。例如，利用温育室，可以控制适当的环境温度。为了能够调查连续盖玻片上生长的几个样品，使用了定制的样品架（见图2）。借助这种构造，可以使活江苏体彩成像。对于活江苏体彩成像或FURA成像的这种用途，盖玻片可以很容易地更换。
小鼠溃疡性结肠炎的研究。 该疾病溃疡性结肠炎涉及结肠的慢性炎症。病人常有腹泻与血液混合。长期失血可导致贫血，这些人患大肠癌的风险更高。
由于溃疡性结肠炎是一种慢性炎性疾病，因此可以假定它与TLR自由基周期有关 [9,10]。为了更仔细地观察，在实验室中使用了鼠标模型进行检查。有趣的是，将DSS掺入动物的饮用水中可引起肠道疾病 [11]。用这种饮食治疗的小鼠表现出溃疡性结肠炎的典型症状。由肠道制成的组织切片可以在明场照明下用显微镜成像。苏木精和曙红（H&E）将江苏体彩核染成蓝色，将江苏体彩质染成红色，可用于从形态上检查小鼠结肠（图7）。
与对照组相比，经DSS处理的小鼠粘膜有明显损伤，整体上皮结构也发生了变化。而且，这些小鼠失去了粘膜的特征性内陷，即所谓的隐窝；并且通常它们的粘膜和粘膜下层被炎性江苏体彩浸润。在之前描述的基于江苏体彩培养的系统之上，该小鼠模型揭示了有关生物水平上慢性炎症的结果。
Discussion
许多疾病，包括神经炎性疾病，例如帕金森氏症或中风，以及全身性疾病，例如（自身）免疫性疾病或癌症，都与慢性炎症有关。了解慢性炎症的分子过程将为应对相关疾病和制定治疗策略打开新的大门。
除分子生物学外，宽视野显微镜也是了解TLR自由基循环（慢性炎症的基础）的一种主要工具。例如，以常规分辨率进行相对简单的免疫荧光显微镜检查，发现在LPS刺激下NF-κB从江苏体彩质到江苏体彩核的移位。 NF-κB作为转录因子起作用，可增强驱动TLR自由基循环的促炎江苏体彩因子的表达。
有趣的是，不仅LPS能够通过TLR4信号激活来启动炎症过程。还有其他来源可以间接触发TLR4信令。这些可以是例如引起自由基或直接引起DAMP产生的纳米颗粒，过渡金属，半挥发性有机化合物或臭氧。如前所述，DAMPs可以激活TLR4途径。自然，有必要进一步研究该过程并破译其背后的机制。
除了探索这个恶性循环的基本过程之外，似乎有办法破坏这种恶性循环。拥有一种用于观察NF-κB易位性（作为炎症指示）的江苏体彩培养模型，可以检查如何阻止这种进展。我们小组目前正在研究许多草药提取物中的物质，它们具有潜在干扰转录因子向核内转移的作用。
除了采用常规分辨率的宽场荧光技术外，还使用超分辨率显微镜方法 [12,13] 甚至在单分子分辨率下也可能提供有关炎症机制的更多细节。
除了蛋白质状态外，江苏体彩的离子成分还可以提供有关炎症过程的信息。通常，离子通道对炎症反应，因为其表达和功能会受到江苏体彩因子的影响。而且，钙 2+ 例如通过炎症小体参与白介素的成熟 [14]。因此，它可以用作炎症进展的指标。当涉及Ca时，比例FURA成像是强大的工具2+ 测量 [8]。建立可靠的工作系统是进一步努力破译TLR激进循环及其破坏方式的基础。将来人们可以想象，通过改变Ca来筛选对慢性炎症有影响的物质2+ 响应。
在这一点上，应该提到比例成像需要快速改变激发波长或检测到的波长，强光源，光学组件的出色透射以及快速的信号检测。超快速滤轮的发展， 紫外线经过优化的光镜，高灵敏度的荧光团以及快速灵敏的摄像头（sCMOS），可以实现高空间分辨率的定量高速活江苏体彩成像。
除了体外研究，还可以在整个生物体内研究炎症过程。因此，患有结肠慢性炎症（溃疡性结肠炎）的小鼠是有趣的研究对象。在这种情况下，其组织学状态可以用作相应组织炎症等级的指标。在此阶段，可以在完整的生物体中研究慢性炎症，例如特殊饮食如何对溃疡性结肠炎产生负面或正面影响。将来，由于其氧化状态而改变其荧光行为的染料的使用将被用作ROS指示剂，以获取更多的见解。
Conclusion
许多不同的光学显微镜技术可用于检查潜在炎症反馈回路许多位置的慢性炎症。对比方法的范围从明场到荧光显微镜，并可以选择比例成像。检查的样品可以具有单个江苏体彩或整个器官的大小。可以观察到固定江苏体彩和组织学切片以及活江苏体彩。有趣的是，对于本报告中描述的方法，研究人员对于所有不同的技术都不需要一个以上的显微镜。由于现代生命科学研究显微镜的灵活性和可升级性，例如显微镜 徕卡DMi8，加上用户友好的成像软件，可以从多个方向突出显示江苏体彩过程。有了这些好处，光学显微镜在生命科学中将保持其地位，并将继续破译江苏体彩生物学现象，并有助于对抗诸如慢性炎症的疾病。
Acknowledgements
Dr. Detlef Schuppan博士请我们为我们的动物实验提供设施。我们非常感谢Frank Helleis博士，Thomas Klimach博士以及马克斯·普朗克化学研究所的工作坊，以生产自制样品架。非常感谢UlrichPöschl博士和马克斯·普朗克学会的支持。
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可以从“今日显微镜”网站下载免费的PDF文章： http://www.microscopy-today.com。请转到存档/先前的问题/第24卷/第6期。
