在线联系我们
文章

收集光:在显微镜下数值孔径的重要性

当试图区分从样品上方观察到的样品中的细节时,数值孔径(缩写为“ NA”)是一个重要的考虑因素。 显微镜。 NA是没有单位的数字,与透镜收集的光的角度有关。在计算NA(见下文)时,还考虑了介质的折射率,并且通过将载玻片或细胞培养容器的折射率与浸没介质进行匹配,可以解决样本的更多细节。当光从一种介质传播到另一种介质时,其行为方式也与NA有关(并称为“折射”)。 本文还介绍了折射的简要历史,以及该概念如何成为实现高NA的限制因素。 

作者

主题 & 标签

Microscope 目的

如果您仔细观察显微镜上的物镜,将会看到各种各样的 信息和号码 刻在枪管上。除了放大倍率和光学校正以外,您还将看到另一个没有单位的数字。这是物镜的数值孔径(或“ NA”)(见图1)。

物镜的数值孔径是一个重要方面,并且与图像有关 解析度。简而言之,分辨率是物镜区分样品中细节的能力。如果没有相应的高NA,则物镜具有很高的 放大 将无法解析样本详细信息。

简而言之,显微镜物镜的NA是指透镜在距观察对象一定距离处聚集光的能力。当光穿过标本时,它以倒锥的形式进入物镜。但是,来自样品的某些光会被折射(并反射),但是具有较高NA值的物镜会使得前透镜越来越多地聚集倾斜的光波,这反过来会产生高度分辨的图像并包含更多细节和信息比目标值低的NA。

Angular Aperture

由物镜前透镜收集的光锥的最大纵向角度称为“角光圈”(图1)。除了增加NA,图像亮度还与角孔径成比例。随物镜焦距变化的角孔径与最大角度有关 样品聚焦的物镜前透镜可以捕获的来自样品的成像光线的分布。

角孔径与物镜的焦距成反比。随着焦距的减小,物镜前透镜可聚集的光量会增加。换句话说,如果物镜非常靠近样品,那么物镜可以收集更多的倾斜光线。应该说,角孔径通常由物镜内的光学系统确定,每个物镜将具有最佳焦距。隐喻地,这样想:如果您站在一扇门前,门上有一个通向另一个房间的钥匙孔,那么当您处于一定距离时,您将只能看到其中的少量光线和物体。房间。从理论上讲,如果将眼睛按在钥匙孔上,那么您将在房间中看到更多的细节和光线,因为从理论上讲,这增加了眼睛的角孔。

由物镜收集并形成的图像亮度和图像细节(分辨率)与角孔径有关。来自样本的光继续通过保护玻璃和物镜前透镜之间的空气或浸入介质。

Calculating NA

数值孔径可以通过以下公式表示和确定:

数值孔径(NA)= n•sin(α)

在上式中,“ n”是防护玻璃和物镜前透镜之间的介质(例如,空气,水或油)的折射率。 “α”符号代表可以由透镜收集的光锥角的一半(即,角孔;见图2)。

空气的折射率约为1.0,而水的折射率为1.3,某些用于光学显微镜的浸油的折射率高达1.52。

Refraction

为了充分理解NA,了解折射是有帮助的。在光学和显微镜中,折射是指穿过和来自样品的光波方向的变化,这是由于光通过的介质(例如空气,玻璃,水或油)的变化而引起的。折射在称为“斯内尔定律”的公式中进行了描述。 Willebrord Snellius(1580-1626)是荷兰的数学家和天文学家。除了确定一种计算地球半径的新方法外,他还因数学上描述折射而受到赞誉。但是,他并不是第一个这样做的人,更准确地说是他“重新发现”了衍射,因为波斯数学家和物理学家伊本·萨尔(Ibn Sahl)曾对此进行了描述。在984年的手稿中,他描述了弯曲的镜片和镜子如何弯曲和聚焦光。

斯涅耳定律指出,入射光和折射光的角度之比等于光通过的折射率之比的倒数。

简而言之,当光从一种介质传播到另一种介质时,它会改变速度-例如,当从空气传播到水时,光会变慢。另外,速度的变化导致光以除90°以外的角度进入介质的方向发生变化。请注意,光的频率不会改变,但是波长将取决于介质的性质。

理论上,由物镜前透镜收集的光锥的最大角孔径将为180°,这将产生90°的α值。由于90的正弦为1,这意味着物镜的理论NA可以为1,该物镜能够从空气中从样品中收集180°的合成光。显然,折射率是实现物镜最高NA的限制因素。因此,高NA物镜是那些使用浸没介质代替空气(例如油或水)的物镜。实际上,样品与物镜前透镜之间的空气的NA不能达到,因此“干透镜”(即非浸没物镜)的最高NA接近0.95。这是由于以下事实:大多数透镜将无法从样品中收集180°的光,并且最大广角约为144°。 144°的正弦值为0.95,而空气的折射率为1.0,则理论最大值NA接近0.95。

因此,具有低NA的高倍率物镜将具有低分辨率。许多显微镜公司提供的物镜具有尽可能高的NA。因此,如果您可以购买显微镜的新镜头,则应始终考虑购买那些在您的预算内提供最大NA的物镜。