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表型和基因型的相关性–显微样品及其生物分子背景

激光显微解剖–用于单细胞或亚细胞分离以及随后的高通量分析的选择方法

眼见为实,这就是使显微镜,成像系统或箱式成像仪对病理研究,癌症研究,神经科学和发育研究等许多不同领域的研究人员如此重要的原因。表型(您可以看到的)和基因型(遗传背景)之间的相关性是非常需要的,但是由于没有真正的解决方案可以可靠地分离感兴趣的单个细胞和周围组织,因此通常会受到整个组织方法的影响。因此,DNA突变分析(测序),基因表达谱(定量实时PCR,qPCR,微阵列,数字PCR),下一代测序(NGS)或质谱(MS)方法的结果可能会产生混合结果,因为没有纯粹的起点可供选择的生物分子方法的材料。

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在液体悬浮液中分离和保存单个细胞的挑战

然而,可获得用于分离,提取和其他纯化方法以获得诸如单细胞之类的纯净起始材料的技术前景,例如。用于单细胞自动制备的FACS(荧光激活细胞扫描)或Fluidigm设备。这些强大的高通量微流体技术面临的挑战是使细胞悬浮。对于细胞分选系统而言,使组织或细胞进入液体悬浮液的这一关键需求可能会影响分子含量,尤其是对于组织环境中的细胞。强烈建议在组织环境中保留细胞的质量和分子生物学模式,可以使用显微镜或任何其他成像解决方案进行观察。因此,以某种方式专门从组织切片中选择,提取,分离,分离,穿刺,吮吸,分类或简单地切出所需的单个细胞,细胞簇或不同层的技术将有所帮助。

冲出细胞或细胞簇区域可能会导致结果有偏差,因为可见表面下的结构可能与您在顶层看到的结构不同。因此,确保获得可靠的纯起始材料的最佳方法是将3D组织分解为连续切片,并从每个连续切片中选择感兴趣的细胞或目标区域作为起始材料。

电生理:伟大的技术,但不适合收集大量的单细胞

电生理学是这种表型和基因型相关性的一个很好的例子。例如,可以在显微镜控制下测量来自重要切片中单个神经元的信号。可以将这种神经元的内含物(细胞质)或包括核在内的细胞体吸入带有缓冲液的特殊针中,以在特定时间点保存内含物。然而,该技术不适用于需要大量单细胞的高通量应用(例如,用于质谱),也不适用于人体组织,因为膜片钳依赖于实验动物的重要脑切片。人体组织通常是冷冻保存的或FFPE(福尔马林固定的,石蜡包埋的)样品,可作为表型-基因型相关性的不可检索的起始材料。迫切需要一种针对各种组织类型(死亡或存活)的通用方法。

激光显微切割:收集纯净起始原料的首选方法

存在这样的技术,称为 激光显微切割(LMD) [1],或激光捕获显微切割(LCM)或激光辅助显微切割(LAM)。最初的发明是在 Leitz Orthoplan提前 [2]。 Arcturus重新发明了该技术,并开始成功地将其商业化。但是,Arcturus的所有权经常发生变化:从Applied Biosystems到Life Technologies,最后到Thermo Scientific(在2016年结束),诸如XT,Veritas,Pixcell和Pixcell II(e)之类的系统仍用于获得富集的靶组织。 棕榈 随后,Lasertechnologies和MMI(分子机器与工业)发明了 棕榈 Microbeam(如今由Zeiss拥有)和MMI CellCut(Plus)系统。

徕卡LMD系统:通过重力解剖收集

后来,徕卡显微系统公司发明了他们自己的解决方案(AS LMD),这与其他解决方案完全不同。主要区别是使用立式显微镜而不是倒置显微镜作为底座,并利用重力来收集无接触且无污染的简单,快速且温和解剖的显微镜ROI(感兴趣区域)。另一方面,激光聚焦像显微镜手术刀一样在样品上引导进行切割,而不是依靠固定的激光聚焦和平台移动进行解剖(台锯原理)。这种重力收集具有很大的优势,因为它可以将这种显微样品的提取技术与最新的分析方法(例如 用于下游分析的液体毛细管系统 [3] 例如质谱或其他任何微流控设备。

激光显微切割:样品切割

激光显微切割应用

徕卡 LMD 系统是带有集成剪刀的显微镜,可将感兴趣的区域切成单个染色体一样细小,直至几百微米厚的木节。如今,这种显微镜提取工具通常用于分离 周围健康组织的肿瘤区域用于突变分析 [4], 单个神经元进行基因表达分析[5] and 神经元层或斑块用于蛋白质组学分析 [6]。除了这些应用领域之外,还有更多 LMD 该系统通常在发育生物学,临床研究,法医学,活细胞培养,克隆和其他研究领域中的应用。提取将以不同的对比方法进行,例如荧光,相衬和明场。