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Cryo Clem - Cryo荧光显微镜与Cryo电子显微镜的组合

通过将荧光显微镜(FM)与电子显微镜的功率相结合来获得许多生物学见解(em. )研究相同的样品 - 这称为相关光和电子显微镜(克莱姆)。在FM中,可以标记和鉴定特异性蛋白质,并且它们的动力学和相互作用可以在固定或活细胞中可视化。在 em. ,可以看到完整的环境上下文,可以获得高分辨率的细节。在本文中,我们解释了概念 克莱姆,特别关注冷冻 克莱姆:低温FM与Cryo的组合 em. .

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荧光和电子显微镜的局限性

当研究细胞内或分子相互作用水平的生物事件时,科学家往往受到FM的空间分辨率的限制。所谓的"super-resolution"方法越来越多地克服这种限制,以允许具有达到数十纳米的分辨率的单个荧光标签的定位。 FM也是有限的,因为它只能观察荧光标记物,并且不提供关于观察到该标记的结构和形态学的信息。该第二限制也可以是优势,因为它提供特异性,允许标记的分子在未标记的分子的密集海中鉴定。

与观察特异性标记的分子相反, em. 可视化电子密度的局部差异。这使其成为分析大分子复合物结构或描述细胞形态和环境的理想技术。在 em. 然而,然而,难以直接区分特定类型的分子。在 克莱姆 实验,FM和 em. 在同一样本中执行以链接FM的特定或动态信息,具有高分辨率或环境信息 em. .

TEM和CRYO EM的样品准备

了解挑战 克莱姆 有必要审查一个属性 em. 样本。在透射电子显微镜(TEM),电子束照亮样品并记录投影图像。当撞击样品时,加速电子相互作用并被吸收或散射。样品需要足够薄的电子束通过样品。由于显微镜柱中存在的真空,还需要在干燥的固态中成像样品,在那里它们不会立即分散到真空中。

生物标本最常见的制备方法 TEM 是通过醇依次替换样品中的所有水,然后嵌入聚合的树脂,得到固体嵌段。然后使用切片机切割该块以产生足够薄的切片 TEM 成像。增强信号和对比度 em. 在样品制备期间,可以加入图像,电子致密材料如重金属污渍。

样品制备的替代可能性是快速冻结样品以玻璃化所有含水。这可以通过将包含薄样本的栅极快速释放到液化气的液体的气体(例如乙烷)中,或者通过使用随后的冷冻切片的高压冷冻装置来实现。该技术的益处是,样品在近尾状态下保持水合,其分子结构是最佳的保留。所结果的"cryo samples"然后可以在中成像 em. (这是Cryo em. ),提供它们在靠近液氮的温度下保持它们。

在Cryo中的图像对比 em. 结果仅从生物分子和周围冰之间的电子密度差异。因此,图像包括关于样品的分子结构的信息。冷冻 em. 可以实现决议 <5 纳米单张图像。当与计算平均方法结合时,利息蛋白质的结构可以在最佳情况下决定为0.3的分辨率 nm.

两个方法

取决于类型的类型 em. 使用样品制备,并且取决于正在进行的FM的类型,可以使用不同的FM 克莱姆 方式。一种方法是在制备随后的样品之前进行活细胞荧光成像 em. 。这留下了在FM和FM中观察到的状态之间至少几秒钟的典型时间差距 em. 由于在固定或固定样品时损耗的时间。因此,这种策略并不理想的是研究快速移动的过程或信号非常精确的信号。第二种方法是执行两者 em. 和FM在相同的样本上,一旦准备好了 em. 。此过程提供高的相关精度。该第二种方法可以应用于特定条件下嵌入树脂中的样品 [1]。它也可以应用于Cryo样本 - 这是Cryo 克莱姆.

冷冻 Clem的挑战和要求

冷冻的特殊挑战 克莱姆 是标本温度必须低于-140 °C始终避免形成结晶冰,并且样品不能暴露于湿度以避免水的冷凝。必须在所有阶段保持这些条件,包括在FM期间,同时在样品制备装置,荧光显微镜和冷冻之间转移样品 em. 装备 TEM.

冷冻 克莱姆 需要一种荧光显微镜,配备有特殊的Cryo阶段,在成像期间保持低样本温度。由于从环境湿度磨损,冷冻阶段必须最小化样品的污染。理想系统的光学性能应使高分辨率成像具有高灵敏度,以允许高精度的相关性。

为Cryo开发了许多Cryo阶段和相关的工作流程 克莱姆。这些包括通过玻璃载玻片与样品分离显微镜目的的倒置配置以及使用长的工作距离目标的直立设置。我们已经利用了一个直立的显微镜配置和冷却的物镜前线,允许我们的Cryo FM设置使用高NA目标,其工作距离短,同时保持标本玻璃成功的Cryo 克莱姆.

使用我们的原始设置,描述 [2],提供了促进徕卡发展的经验 em. 冷冻 克莱姆 solution (Figure 1)。该解决方案可以执行Cryo 克莱姆 以一种更可靠和直观的方式。

为什么Cryo Clem如此有用?

冷冻 克莱姆 允许我们根据其荧光信号识别有趣的生物对象(这可能是动态,罕见或以其他方式难以找到)。然后,我们可以定位相同的对象并通过Cryo获取上下文中的高分辨率结构数据 em. (Figure 2)。在许多情况下,这些信息不能以任何其他方式获得。

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