低温电子断层扫描工作流程以及为何需要低温光学显微镜
关于人体生理学和病理学的许多科学问题只能通过研究潜在的细胞机制来回答。它们是任何功能组织，器官和整个生物的基础。
为了了解健康和病理生理条件下不同细胞类型的功能，确定参与的生物分子（例如蛋白质）并在分子水平上检查其相互作用至关重要。
为此，低温透射电子显微镜（Cryo 透射电镜）用于在其细胞环境中将生物分子解析到1 nm以下的空前分辨率。这样，可以识别单个蛋白质而无需任何标记，仅凭其形状即可。此外，甚至可以区分不同的构象及其在细胞质内的分布。
作为前提，必须使用复杂的技术（玻璃化）将标本冷冻固定，以避免形成破坏性的冰晶。与其他固定技术相反，蛋白质保持尽可能接近天然状态。之后，可以在冷冻机中直接评估薄样品（小于300nm） 透射电镜。通过倾斜样品，可以创建并重建观察到的样品量的3维数据集，以获取感兴趣的相关蛋白质的3D分布（图2，低温电子断层扫描）。
为了观察样品的“较厚”部分，必须将样品稀释。除了冷冻超薄切片术，聚焦离子束（FIB）选择专用的低温扫描电子显微镜进行铣削。放置两个离子束窗口的方式是，在感兴趣的区域生成约200 nm厚的薄冰片（薄片）。这样，即使是无法调查的标本的一部分，也可以使用Cryo ET（图3， FIB 铣削）。
由于工作流程很繁琐，因此需要很多步骤，而在EM上的材料和成像时间却很昂贵，因此在早期确定样品的质量和靶标在网格上的存在至关重要。此外，一个主要的挑战是找到精确的研磨位置以确保薄片包含目的蛋白。
为了克服这些挑战，低温显微镜是工作流程的重要组成部分。使用低温显微镜可以检查样品的质量，最重要的是，可以使用遗传编码的荧光标签确定目标结构的位置（图4）。
这些标记可以选择性地可视化，并揭示2D和3D中任何感兴趣的结构的位置。关联荧光和 扫描电镜 图像可以分配潜在的铣削部位（相关的光和电子显微镜， CLEM）。
尽管出现了许多挑战（样品的安全冷冻转移，冷零件上可能的水凝结，低温使用的物镜……），但仍可以使用商用冷冻光学显微镜。
低温显微镜和除雾
徕卡显微系统公司提供专用的低温显微镜THUNDER Imager 电磁 低温 CLEM，它配备了最新的LED技术和高度敏感的最新科学技术 CMOS 相机（图5）。
通过遵循软件工作流程，可以完整了解样品架（电磁 可以在不到一分钟的时间内创建网格），并且可以检查网格上支撑膜的完整性。第二步，目标荧光信号的分布和适当区域的定位，以便后续进行 FIB 可以确定铣削。
不幸的是，尽管宽视野显微镜是一种非常灵敏的技术，因此非常适合低温成像，但在图像中仍会观察到背景噪声。这种背景主要来自样本的失焦区域，大大降低了系统的对比度和潜在的信噪比（SNR）。记录的图像通常显示雾度，并且可能无法提供正确瞄准目标结构所需的详细程度。
为了解决这一广角问题，徕卡显微系统公司开发了全新的成像系统系列THUNDER Imagers，该系统以计算清算为核心技术。每次获取图像时，都会检测并消除离焦背景，从而可以直接访问感兴趣的信号。同时，在对焦区域中，保留了标本特征的边缘和强度。
特别是对于生物样品，背景通常在整个图像中不是恒定的。在整个视场中，它可能变化很大。计算清除会自动考虑到这一点，使对焦信号立即可见。
THUNDER Imagers提供三种模式可供选择：
- 即时计算结算（ICC）
- 小批量计算清算（SVCC）
- 大容量计算清算（LVCC）
ICC对应于如上所述的计算清除。
SVCC和LVCC是计算清除和基于决策掩码的3D反卷积的组合，专用于稀疏样本（SVCC）或稠密样本（LVCC）。反卷积方法的自适应图像信息提取遵循了一个概念，该概念是从最初为共焦显微镜开发的徕卡显微系统公司的自适应反卷积方法LIGHTNING演变而来的。
闪电使用决策遮罩作为基本参考，为图像系列的每个体素计算一组适当的参数。结合广域点扩展功能（PSF），可以将LIGHTNING的功能转移到广域检测中（可以找到更多信息 这里.
THUNDER的分辨率提高
将小体积计算清除（SVCC）应用于单个，不重叠，衍射受限的对象可提高分辨率。在给定的示例中，对直径为40 nm的单个珠子进行了成像（100倍放大镜，NA 1.44），并应用了SVCC。取决于样本的结果是横向分辨率提高*约2倍（使用SVCC / Raw = 0.51时X的FWHM比）和轴向分辨率的2.5倍（使用SVCC / Raw = 0.39时Z中的FWHM比）。
*分辨率增强由发光点光源的外观大小定义。在衍射极限以下将彼此靠近的两个结构分开是不可能的。
用THUNDER Imager 电磁 低温 CLEM成像的玻璃化样品
由于THUNDER技术首先成功地用于在环境温度下对样品成像，因此Leica专家随后提出了在低温条件下应用该技术的想法。从宽视场冷冻图像中去除雾度特别有用，因为它不仅可以改善图像质量，而且还可以确保对后续结构进行更可靠的识别 电磁 工作流程步骤（即 FIB 铣削和 透射电镜 分析）。
图8显示了用THUNDER技术（THUNDER LVCC）观察到的酵母细胞。在左侧面板上，可以看到细胞壁绿色自发荧光的散焦雾霾正在干扰核仁的鉴定。一个人可能会争辩说，绿色荧光可以从覆盖图像中去除，但是同时需要可视化细胞壁以鉴定未附着的核仁。使用THUNDER后，背景雾度降低，同时信号得以保持；细胞壁和核仁清晰可见，易于识别 FIB 铣削目的。
THUNDER技术的应用是在不同的样本上进行的。图9显示了另一个示例：A9细胞用与鬼笔环肽结合的绿色荧光染料标记。鬼笔环肽选择性结合纤维肌动蛋白，在真核细胞中发挥结构性作用。在左侧面板中，微小的结构被散焦光所隐藏（见箭头），但是在THUNDER SVCC之后，它们在右侧面板中变得可见。
F-肌动蛋白非常薄，纤维结构显示即时改善，非常适合THUNDER成像。图10还与mCherry标记的F-肌动蛋白一起显示了囊泡结构： 绿色荧光蛋白 荧光。 TGN将新蛋白引导至不同的亚细胞目的地。桑德勒还揭示了这些小的囊泡结构，同时消除了散焦光引起的模糊。
Summary
在本文中，我们展示了Leica Microsystems的THUNDER成像技术如何使用计算清除技术提高在低温条件下从玻璃化样品中拍摄的图像的质量。通过消除主要由散焦光引起的雾度或模糊，甚至可以看到微小的结构。 THUNDER成像技术不仅可以提高图像质量，而且还可以帮助您更轻松地识别结构以便后续进行 电磁 分析步骤。
