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使用STED和可交换的荧光团扩展纳米显微镜的可能性

用于全细胞，3D，多色和活细胞STED成像的明智策略

到那个时刻 STED 纳米显微镜保持高信噪比是在固定细胞和活细胞中获得最佳分辨率的关键。在3D和/或时间序列中进行实验的情况下，这可能是一个挑战，在这种情况下，样本会经历许多轮图像采集，并且光漂白成为一个问题。

如果荧光团完全不受光漂白的影响，则应该可以 STED 无限期地反复使用相同的分子。在实践中， STED 在亮度和光稳定性方面具有最佳的荧光团（Grimm，Muthusamy et al.2017）[1]，并且具有高标签密度。但是，有一个更聪明的选择可以更接近理想的情况：如果“新鲜”荧光团在每轮 STED，每次成像都将使用完整的荧光团进行。这个概念是 STED 与可交换的荧光团结合使用，该物质是在Mike Heilemann的实验室中与来自海德堡EMBL的Marko Lampe合作开发的。这种方法可实现全单元，3D，多色 STED 成像以及活细胞 STED 显微镜用于长采集时间和1 Hz成像速率。这项工作最近在杂志上发表了 纳米字母 （Spahn，Grimm et al.2019）[2].

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STED Nanoscopy带有“无限”的荧光标记池

使用瞬时结合其靶标的荧光团的想法是从称为PAINT（纳米尺度地形学成像中的点累积）的单分子超分辨率方法改编而来的（Sharonov和Hochstrasser 2006）[3]。 PAINT的主要优势在于其光漂白的独立性：荧光团反复且短暂地结合到其靶标上，而在其他情况下则在成像缓冲液中自由扩散。

遵循这个概念，作者考虑了通常用于PAINT的可交换标签也用于其他成像方式，例如共聚焦显微镜和 STED 纳米显微镜。这些荧光团标记的前提是目标结构的快速交换动力学和高密度标记。与单分子PAINT成像不同，这需要更高的浓度以及合适的结合亲和力（〜µM）和脱键动力学（〜10-100 s-1）。作者评估了五种标签的性能，包括两种膜染色剂（尼罗红，FM4-64），两种荧光DNA染色剂（JF646-Hoechst，SiR-Hoechst）和肌动蛋白标记肽Lifeact-AF594。他们确定了荧光团在目标结构和自由池之间交换的能力，随时间变化的荧光信号以及由此产生的结果。 STED 画面质量。重要的是，某些荧光团是细胞可渗透的（例如尼罗河红和SiR-Hoechst），因此适合活细胞实验。研究的所有染料均与相同的耗尽波长（775 nm）兼容，并允许简化两种颜色 STED 成像：尼罗河红，FM4-64和Lifeact-Alexa 594可以与一种DNA染料（JF646-Hoechst或SiR-DNA）轻松组合。

图1： STED 使用一种耗尽波长（775 nm）对可交换荧光团尼罗红染色的固定细胞中的线粒体进行成像。放大区域（白色正方形）显示了共焦和 STED，其中线粒体的ista已得到明确解决。图片提供：德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学的Mike Heilemann教授和德国海德堡的EMBL的Marko Lampe博士。

结果表明，可交换的荧光团可实现允许高品质标记的密度 STED 低背景成像。在2D和3D固定细胞成像中，使用最佳成像条件进行的恒定交换（图1）。一个特别的好处是 STED 大量（例如整个细胞）的成像：除了永久性标记外，可交换的荧光团标记不显示面外光致漂白。 Lifeact-AF594和JF646-Hoechst在真核细胞中的组合显示出了优势 STED 用于多色：Lifeact肽标记的肌动蛋白，而JF646-Hoechst将纳米特征靶向DNA（图2）。的 STED 方法对于多色3D也很成功 STED 在哺乳动物和细菌细胞中成像。因此，全细胞，两色3D上的图像 STED 沿轴向显示随时间变化的恒定荧光信号。在这两种情况下，动态荧光团交换都可以避免可能影响信噪比的光漂白问题。

图2：两种颜色 STED 成像用两个可交换的荧光团标记的细胞并使用一个耗尽波长（775 nm）（顶部和中间：用Lifeact-AF594和JF646-Hoechst标记的HeLa细胞；底部：用Nile Red和JF646-Hoechst标记的大肠杆菌）。图片提供：德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学的Mike Heilemann教授和德国海德堡的EMBL的Marko Lampe博士。

综上所述，组合 STED 可交换的荧光团为全细胞，多色和活细胞提供高标记密度 STED 成像。可互换的标签不仅有利于3D和活细胞测量，还可以优化 STED 成像时不会像永久标签那样丢失信号。该概念可以扩展到其他标签，并为 STED 在相关成像方法中。

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