讲解

在干草堆中找到针

筛选与分析

科学旨在了解事物为什么会发生变化。这在生命科学中最为明显,在生命科学中,变化是生物发展的动力。它们通常是由临时事件引发的,即使在大型个体中也很少发生–因为与样品的寿命相比,事件时间非常短。现代技术允许 长时间观察许多物体。如果一个人中的假定事件变得可检测,则系统可以将焦点集中到该位置并以高时间和空间分辨率记录数据。

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主屏幕:观察许多人的成长

“主屏幕”的目的是找到并找到感兴趣的候选对象或结构。这是通过低分辨率,低光学切片性能以及尽可能少地改变样品的目的来实现的。另一方面,必须以最大扫描速度执行主扫描,以免错过大量对象中的短事件。通常,用于筛选的样品会在多孔板中生长。这些是包含多个腔体(此处称为“孔”)的聚合物级插入物。在每个孔中,单个个体或少量例如细胞通常在生长。孔板的网格结构使对象易于重新放置和更改监视。为了适合不同的样本大小,可以使用带有6、24或96孔等的孔板。例如,处于不同发育阶段的斑马鱼胚胎是在多孔板中分析的典型对象(将一个鱼胚播种到一个孔中)。主筛的目的是在适当的时间分辨率下获得有关每口井的足够信息。然后,此信息将用于识别和确定感兴趣的孔中的哪些样本,并应在所谓的“辅助筛选”(请参见下文)中进行进一步调查。

初步筛选是通过观察大视野来进行的。有时照相机适合完成此任务。共焦提供了更好的对比度,现代系统提供了低放大率的光学器件,可以一次成像完整的井。在大针孔设置下进行共焦成像就足够了(这也可以发现失焦事件)。两通道记录也很有用,例如同时显示荧光图像和透射光图像。初次扫描所需的所有参数都存储在“扫描作业”中,可在分析罕见事件后继续进行筛选过程或第二天开始新实验,以进行检索。

在开始矩阵筛选实验之前,系​​统需要知道开始坐标以及孔在x和y方向上的距离。当井以规则的直角坐标系对齐时,系统可以按常规方式自动从井上移至井上,从左上到右下或以预定的顺序进行,其中所有井在操作员手动选择后进行处理。可以创建不同的扫描作业,并在多个位置自由组合。为了再现性,这些屏幕,xy坐标以及所有其他相关的成像扫描参数都可以存储在模板中。将参数存储在模板中的优势是显而易见的:如果交换多孔板,则仅需重新调整起始坐标。

这种自动化节省了大量时间;以标准化的方式可以在更短的时间内进行更多的实验。

确定罕见事件

在主屏幕期间,其中一个人偶尔会开始修改其形状或其他光学属性(例如,荧光强度,颜色比率等)。一个典型的例子是从静止核(G相)到分裂核(有丝分裂)的变化。在这里,核染色会显着改变形状和强度。

调查有丝分裂细节的一种可能性是,通过观察监视器上的图像来检查所有物体,并手动指示应该进一步检查的井。在许多情况下,此过程已经是识别和跟踪罕见事件的非常强大的工具。

如今,现代软件通常可以代替人类识别技能。当前,模式识别软件可用,可以自动识别诸如球体,线和各种复杂模式的巨大工具箱之类的形态。来自主屏幕的图像将在线传输到图像分析计算机,在继续进行筛选过程的同时进行并行处理和评估。模式识别规则可以随时修改,以适应实验变化或新思想和研究目标。由于计算机是通过网络连接的,因此规则集的监视和修改甚至可以在家庭办公室进行,包括显微镜的远程控制。

本质上,识别过程会在多孔板上产生一个坐标,该坐标标记了所寻求的罕见事件的位置。然后将此坐标传回系统。

高精度记录和分析罕见事件

当发现感兴趣的事件时,任务是非常详细地记录和分析结构和时间变化。为此,系统必须居中关注对象并执行预定义的数据采集计划。通常在高倍率和高分辨率下。在发现包含罕见事件的井中将对象居中称为“单个对象跟踪功能”。这是一项单独的工作,它确定井内的确切坐标并移动平台,以便将这些坐标居中以进行进一步的数据采集。这也很重要,因为在实验过程中对象可能会移动。也可以交互式居中,然后单击一次鼠标即可激活高精度采集。对于其他任务,可以存储一系列确定的位置,然后自动进行记录。

高精度记录(“辅助屏幕”)以高放大倍率和高像素分辨率完成。在这里,光学变焦系统(变焦)非常有用,因为它可以在不机械地改变物镜的情况下改变放大倍率,并且不容易出现偏心现象。显微镜的所有参数会随放大倍率的变化(例如针孔直径)自动调整。除了在x和y中对中外,还必须找到并识别对象的正确z位置。为此目的,实现了自动聚焦程序。

高精度扫描的其他参数可以预存储在扫描作业中。这些参数包括,例如,扫描速度,扫描格式,光谱特性,扫描模式,重复等。高清晰度的一个非常典型的记录包括一个三维z堆栈,可以分析罕见事件期间的结构变化和相互作用。

由于可以定义和组合不同的扫描作业,因此可以使用宏功能,从而可以在单个位置执行复杂的实验。此外,可以将实验分配到各个位置并进行循环以进行长期高清观察。