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电影 烦恼和生物传感器:生物医学研究的多功能工具

荧光寿命成像(电影)与福斯特共振能量转移(烦恼)已被证明对于生物医学研究中的各种结构元素和细胞动态变化非常有益。 烦恼 允许监视分子相互作用,因为 烦恼 信号在很大程度上取决于两者之间的距离 烦恼 伙伴。这允许研究分子的相互作用,例如配体-受体对,蛋白质-蛋白质相互作用或效应子与DNA的相互作用。另一方面, 烦恼 原理已被用于设计传感器,从而改变了 烦恼 配体结合或释放后探针内部两个荧光团的效率。在这种情况下,我们有两种类型的分子相互作用: 烦恼 传感器中的分子伴侣以及探针与配体的相互作用。本文介绍了组件方法(电影烦恼)以及它们的组合如何打开广阔的应用领域。

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测量特定参数需要特定传感器。温度通过温度计测量,速度通过速度计测量。生物医学研究通常涉及测量细胞或细胞外液体中的参数。在这里,研究人员感兴趣的参数不计其数:例如,各种离子,小分子或其他代谢化合物,甚至极性或电势都是关键。研究人员想要测量这些参数以释放生命,宇宙和一切背后的真相。如今,大多数生物学参数的探针都是基于荧光的。取决于所分析物的浓度,荧光探针的亮度可能会增加或减少。不幸的是,强度不仅受荧光染料浓度的影响,而且受照明强度,由于漂白引起的降解以及吸收和遮蔽效果的影响。为部分地避免这些问题,优选比例染料,其与落在该荧光染料光谱内的恒定背景相比,可以校准荧光染料的发射。但是,由于再现性有限,基于强度的探测仍然不是很可靠。它还需要详尽的校准和校正方法。荧光寿命成像提供了一种更好的方法(电影)。寿命与染料浓度,照明强度以及样品中的吸收和散射无关。因此,这些在实验期间的变化在寿命方面没有差异。另一方面,荧光寿命在很大程度上取决于分子环境,这使得测量环境参数的影响变得可行。在分子环境的特殊情况下,可能存在第二种染料可以吸收第一种染料的激发能- 烦恼。此过程为寿命测量提供了一种灵敏的方法。对于这种组合技术,越来越多的探针(“分析仪”)被开发出来,可用于生物医学研究: 电影 烦恼 生物传感器。

What is 电影?

适当的光子会激发荧光。吸收光子后(蓝色箭头,图1a),电子系统释放少量热量(图1a中的虚线)。因此,与吸收相比,发射的光子具有更长的波长(图1b)。代替自发发射,可以通过与低能光子相互作用来触发能量释放(图1c),这被称为受激发射,这是激光辐射的必不可少的过程。 STED显微镜。最后,能量也可以完全释放而不释放光子,从而降低了荧光效率(淬灭,图1d)。

荧光图像通常被认为是发射光的二维强度分布。强度可以作为激发波长或发射波长或两者的函数来测量。发射检测可以通过一系列同时检测到的光谱带,增加的光谱带或两者的组合来执行。结果用于创建彩色图像,分离信号通道,识别时空相互作用等。然而,荧光过程提供了更多的信息:荧光寿命与强度无关。该寿命可用于在受控条件下识别和分离荧光物质,并揭示有关分子环境的详细信息。

激发后,荧光分子在激发态停留一定时间,然后衰减回到基态。它们停留在激发态的时间是不可预测的,因为它是量子力学控制的随机过程。这种行为的一个众所周知的例子是不稳定原子核的放射性衰变,这是由半衰期确定的,半衰期对每种核素都非常特定。对于荧光,寿命被描述为特征寿命, τ,用于激发的化学物质。除了通过强度特性进行分离之外,这还使使用寿命成为区分荧光染料的一种手段。

荧光寿命图像(电影因此,)不代表每个像素(像素)的强度,而是提供有关寿命的信息 [1]。经典的测量方法(时间相关的单光子计数,TCSPC)确实可以测量荧光的单个事件。像素信息要么是“平均到达时间”,即在该像素中测量的所有寿命事件的平均值,要么是一个或多个特征时间,这些特征时间是通过曲线拟合从到达直方图中提取的(图3)。为了获得显着的结果,应该测量每个像素约400个事件。

What is 烦恼?

福斯特共振能量转移(烦恼)是一种淬灭现象,会影响荧光测量。除了发射光子,分子还可以释放全部激发能而不发射辐射。 (淬火,图1d)。如果淬灭分子再次是荧光染料,则该能量通过共振而作为能量量子转移,而没有从供体(D)辐射到受体(A)荧光染料的辐射(图3)。因此,释放的能量不会作为热量散发,而是以受体荧光染料的激发态存储 [2]。对于 烦恼 为了发生这种情况,要求受体的激发必须与供体的发射光谱重叠,并且两个分子还必须具有紧密的接触和正确的取向。在本文中,“关闭”表示该距离不应超过约10纳米。分子越接近, 烦恼 发生。

烦恼

距离与传输率的关系,kF由等式描述:

R₀ 表示“福斯特半径”,是转移效率为50%时的距离,即一半的激发供体分子可以将能量量子转移至受体。对于每个供体-受体对,福斯特半径均假定为特定值。供体激发的特征寿命由下式表示 τD  和两个分子之间的实际距离为r。由于转移速率与提升到6的幂的分子之间的距离成反比 烦恼 仅在供体和受体密切接触时发生。不过,这种关系是独特的,因此,最初 烦恼 用于估计分子距离(“分子尺”)。绝对的 烦恼 另外,效率取决于供体发射和受体激发的重叠积分以及两种荧光染料的跃迁矩的方向。

发生 烦恼 通过几种现象变得明显。首先,样品(受体)将发出荧光色,这是所施加的激发色所不希望的。对于图3中的示例,在蓝色激发之后不会出现红色发射。可以测量该发射并将其与原始发射(一种称为“敏化发射”)的方法进行比较。敏感的发射表明发生了 烦恼 以可量化的方式。这样的测量可以在生物材料中进行,但是如果在强度模式下进行,则需要进行复杂的校正,因此容易出现各种校准错误。同样,寿命测量是选择的方法。的效果 烦恼 最后一节将说明寿命。

另一方面,由于某些激发态转变为受体激发,因此施主的发射将减少。这种现象在一种称为“受体光漂白”的方法中得到了利用,其中通过光漂白根除受体后测量供体发射的变化。去除受体后,施主发射将增加。此方法仅适用于固定样本。

FLIM 烦恼和生物传感器

为生物起源的传感器选择术语“生物传感器”。这可能是蛋白质或肽,DNA或RNA片段,细胞等。甚至整个生物体都可以用作生物传感器,例如在死亡率筛选设置中的淡水鱼中,可以检测到水的有毒污染物。在更技术的背景下,生物传感器表示包含生物部分和用于测量分析物浓度的电路的复合传感器。例如,众所周知的是葡萄糖生物传感器,糖尿病患者用来控制血糖的快速而简单的装置。 电影-烦恼 生物传感器通常指示使用荧光(寿命)作为信号的分子, 烦恼 作为一种敏感现象。

到现在为止,我们已经具备了了解背景知识的背景 电影 烦恼 生物传感器的工作。第一部分是感测剂:通常是一种与分析物(目标分子)相互作用的蛋白质或肽。蛋白质和肽可以通过基因工程方便地引入靶生物,因此是优选的传感分子。一个著名的例子是钙调蛋白。钙调蛋白可以结合钙2+ 离子结合并解离后会发生构象变化。

第二部分涉及荧光。我们需要用一对可以进行能量转移的荧光染料标记传感分子。荧光染料必须以某种方式连接到传感剂,以使其在一个构象状态下相距较远且无法执行能量转移,但在另一种构象状态下,它们应紧密,正确定向并随后进行能量转移。如果这样,传感器会结合或释放分析物, 烦恼 会发生或消失。我们可以通过例如敏化发射来测量结合或释放。如果选择荧光蛋白作为荧光染料,则整个生物传感器可以通过基因表达,因此可以引入任何生物靶标对象,甚至包括特定的亚细胞位置。合适的对例如是作为供体的CFP(蓝绿色荧光蛋白)和作为受体的YFP(黄色荧光蛋白)。

最后一位是寿命测量。如上所述,按强度进行的敏化发射测量容易产生明显的误差,并且需要繁琐的校准测量和复杂的校正。这主要是因为强度受许多其他参数的影响,而不仅仅是那些影响强度的参数。 烦恼 处理。寿命基本上仅取决于荧光染料的种类和分子环境,在这种情况下,受体的丰度是探测机理的基础。的情况下 烦恼与纯荧光发射相比,寿命缩短。在图4中,通过使用储水槽(类似于激发态储水槽)的类比来表示缩短时间。如果供体只能发出荧光(绿色),则只有一个排水口可以控制清空容器的速度(a)。如果供体可以将能量转移给受体,则在储液罐(红色)中打开第二个排水口,结果是储液罐将更快排空(b)。

烦恼动力学

供体分子激发态E的荧光衰减D,由闪光灯激发后,可以通过简单衰减到基态G来描述D,并发出荧光光子,pD:

相应的速率方程为:

哪里kf 是荧光发射的反应速率。整合收益

哪里E0D 表示闪光后的激发态的初始数量,tf 特征时间(tf=1/kf)。的 烦恼 淬灭过程与普通荧光竞争,产生激发的受体分子E一种, 通过非辐射过程,因此:

在这种情况下,kr 表示非辐射传输速率:

视在特征时间τ烦恼,当发生福斯特共振能量转移时,比纯荧光发射的特征时间t短f:

这种寿命上的差异用于检测结合特定分析物(分子内)后传感器的构象变化 烦恼)。当然,被适当覆盖的两个分子之间的任何相互作用 烦恼 可以以相同的方式调查伴侣(分子间 烦恼)。

因此,如果我们测量供体的寿命变化,我们可以监测传感剂的构象转换,并由此监测分析物浓度的变化。如果结合构象导致更低 烦恼,供体寿命将相对于分析物浓度增加,反之亦然。

为了以足够的精度和速度测量荧光寿命,以进行体内动态变化,仪器需要高灵敏度,允许快速帧频以及探索与时间相关的单光子计数边界的适当方法 [3].

FLIM-FRET测量示例

为了说明力量 电影-烦恼 在现代生物医学科学中,将举几个例子。 电影 烦恼 应用不仅涵盖用于分析物检测的生物传感器,而且涵盖蛋白质,肽,核酸等的多种相互作用。非常典型地,使用发出青色和黄色光的荧光蛋白CFP和YFP或衍生物。为了提高可读性,草图以绿色和红色显示这些发射。

2+ 离子在细胞生理中具有许多重要作用,例如,作为细胞信号传导中的次要信使。它是肌肉收缩中的必不可少的成分,能够释放神经递质,并有助于活细胞的膜电位。它也是许多酶反应和血液凝结的重要因素。

为了研究这种功能,有必要在活细胞内快速且灵活地操作探针。标准之一 电影-烦恼 生物传感器的例子是钙2+-指标“ cameleon”,钙表(参考引言部分)。各种各样的喀麦隆,如变色龙一样,它的名字表示钙的敏感性及其颜色的变化。 [4].

喀麦隆探针中的传感剂是钙结合蛋白钙调蛋白。与钙结合后会发生构象变化。具有两种荧光蛋白的构建体,例如CFP和YFP,构成了 烦恼-生物传感器(参见图5)。

cameleon钙传感器显示 烦恼 当结合Ca 2+离子时,即在钙存在下寿命会缩短。

在细胞信号传导中同样著名的第二信使是环状AMP(cAMP),它在盘基网柄菌子实体的发育过程中被认为是形状协调剂。 [5]。环状AMP是无法通过细胞膜转移的激素的细胞内信使,因此在碳水化合物和脂质代谢中具有关键作用。它也参与某些离子通道的调节。

与cameleon类似,可以通过将cAMP结合蛋白Epac与两种荧光蛋白融合来创建生物传感器 [6][7].

cAMP传感器Epac显示 烦恼 在没有cAMP的情况下,即在存在cAMP的情况下,寿命会增加。

另一种方法是非侵入性地绘制3D细胞培养物中代谢状态的时空变化图 [8]。在这里 烦恼-生物传感器(T2AMPKAR)用于监测肿瘤球体中AMPK(5'腺苷单磷酸激活的蛋白激酶)的活性。为了使球状体充分成像,通过双光子激发来进行激发。

这些示例仅是其中可能的一小部分 烦恼 生物医学研究中的测量。蛋白质,配体与受体的相互作用,DNA与蛋白质的相互作用或DNA与RNA的相互作用都可以通过荧光方法进行研究。它们中的许多已经为比色皿荧光测量方法建立了,但对于动态成像也有很好的潜在应用。因此,寿命成像领域将在不久的将来显着增加。