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讲解

光漂白后的荧光恢复(FRAP)及其后代

FRAP (光漂白后的荧光恢复)用于表征细胞分子的迁移率。实验装置包括显微镜,光源和与目标分子偶联的荧光探针。采集使用低光照水平的几幅图像以确定初始荧光,然后在目标区域内短时间内使用高水平的光对荧光进行漂白。最后,获取另一组图像,该图像使用足够低的光水平以防止进一步的漂白,从而通过荧光的恢复深入了解分子的重新分布。

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光漂白后的荧光恢复(FRAP)

FRAP 这项技术首先用于分析细胞膜内单个脂质分子的迁移率。 FRAP 也可以用于研究膜外的蛋白质动力学:可以监测细胞质内感兴趣区域或细胞内细胞结构。

可以使用共焦激光扫描显微镜进行光漂白实验,其中高强度的激光用于漂白,低强度的激光用于图像记录。它采用短激光照射活样品中的荧光团以消除荧光,然后对样品进行时间分辨图像记录。结果 共有三种不同的图像序列:设置为参考值的低激光功率的预漂白序列,在ROI内具有高激光功率的漂白序列和设置为低激光功率的后漂白设置以检查荧光的恢复。所有其他漂白方法均源自该基本方法 原理(图1)。

通常,通过表达为 绿色荧光蛋白 (从水母A. victoria克隆的绿色荧光蛋白)融合蛋白或通过用反应性配体标记目标蛋白,然后结合荧光染料。荧光标记的最常见方法 活细胞中的蛋白质是 绿色荧光蛋白 技术。不同光谱 绿色荧光蛋白 突变体EGFP是最好的,因为它的高量子产率,低的光漂白趋势以及在漂白后图像采集过程中的相对光稳定性。重新分布的速度取决于分子大小或环境粘度或与其他分子的相互作用程度或细胞内转运过程。另外,可以确定可动分子与不可动分子之间的比例。

由于取决于应用的实验可能性很多,因此没有关于实验类型的一般方法。请参考参考文献部分中引用的文献。

图1:顶部:时间序列中Bleach-ROI的荧光强度,漂白间隔标记为红色。下图:时间序列中示意图中的同一单元格。在时间点二,细胞内的目标区域(ROI)被漂白(箭头)。未漂白的分子正进入ROI。可以确定重新分配的速度。

光漂白(FLIP)中的荧光损失

通常,FLIP用于检查诸如ER或高尔基体的细胞器是否相互连接。 FLIP实验可以洞悉分子是可移动的,固定的还是仅限于区室。

图2:在时序图中的示意图中显示了同一单元。从时间点2开始,单元内的目标区域(ROI)会反复被漂白(箭头)。漂白的分子正在扩散。荧光的丧失表明细胞器是否物理连接。

Inverse FRAP

与之相反 FRAP ,逆 FRAP (一世- FRAP )可以直接分析荧光分子。细胞器外部的荧光分子被漂白。因此,可以直接监测荧光分子从细胞器中流出,而无需漂白它们。缺点是该方法需要大量的光强度才能漂白整个细胞。

图3:在时间序列内的示意图中显示了同一单元。在第二个时间点,整个细胞区域都被漂白(箭头)。未漂白的分子正在扩散。可以测量细胞中荧光的恢复速度。

光漂白后的荧光定位

光漂白后的荧光定位(FLAP)是一种比例方法,可以应用于两个通道。该实验需要两种不同的荧光标记,并且仅漂白两种标记中的一种​​。这两个标记可以标记为两种或一种蛋白质。非漂白种群是参考措施。然后,漂白的面积与第二非漂白的面积之比可洞察蛋白质的迁移率。 In contrast to FRAP 和FLIP,这是一种直接的测量方法,可应用于结构变化非常快的结构。

图4:在时序图中的示意图中显示了相同的单元。在第二个时间点,用合适的波长漂白(箭头)ROI(例如,仅漂白红色荧光)。