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荧光蛋白-从开始到诺贝尔奖

荧光蛋白是近来荧光显微镜及其现代应用的基础。他们的发现和随之而来的发展,是上个世纪生命科学领域最激动人心的创新之一,也是无数自然现象破译的起点。本文致力于通过科学投入参与荧光蛋白命运的人们。从一开始到获得诺贝尔奖,它应该深入了解最美丽的生化工具之一的漫长道路。

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早期荧光观察

人类对荧光蛋白的兴趣可以追溯到公元一世纪,当时罗马自然哲学家Pliny the Elder [1](Gaius Plinius Secundus,公元23年–公元79年)描述了地中海发光的水母(Pulmo marinus)。在他的眼中,这些动物发出的光线如此之强,几乎可以用作手电筒(Bohn,1855年)。在这种水母旁边,还有很多其他生物吸引了我们的注意力,因为它们在黑暗中发光。实际上,他们这样做并不是为了引起我们的钦佩,而是与其他物种进行交流(萤火虫例如对伴侣施加拉力),吸引猎物(例如frog鱼)或吓倒掠食者(例如短尾鱿鱼)。这些引人入胜的生物中的一些生活在黑暗的世界中,例如深海,那里的光是原始财产。而只有前200名 m的海洋被阳光穿透,在该边界的下方,生活在该处的生物仅产生了现有的照明。

利用化学发光和荧光发光,进化是基于几个人的科学好奇心而开发的,是近代生物化学和细胞生物学中最令人印象深刻且功能强大的工具之一。他们的努力和发现应在下面提及。

随着中世纪对自然科学的关注,西班牙医生和植物学家尼古拉斯·莫纳德斯(NicolásMonardes)等人在1565年描述了一种由轻木制成的闪闪发光的木材提取物。此后,这种光可归因于黄酮类化合物的氧化产物。在这种植物中显示出发光不仅限于动物。三个多世纪后(1858年),爱尔兰数学家和物理学家乔治·加布里埃尔·斯托克斯(George Gabriel Stokes)为这种自然现象产生了名字:荧光。他在发出蓝色荧光的矿物萤石之后想出了这个名词,并扩大了观察从动物到植物到石头的辐射物体的范围。

GFP的突破

日本生物化学家尾村修(Osamu Shimomura)是现代最早的研究人员之一,他们开始对荧光蛋白进行系统的研究。他与老普林尼(Pliny the Ellen)共享荧光水母的兴趣,并建立了维多利亚水母(Aequorea victoria)作为他的"object of desire"在1960年代初期。 Shimomura被维多利亚A.迷住了,因为它能够通过荧光发出绿光。它的栖息地位于太平洋,以贝类和其他水母为食。光是在所谓的发光器官中产生的,发光器官排列在生物体下侧的一个环中。 Shimomura在毕业期间就已经研究过一些虾仁的萤光素,他解剖了这些器官,并通过筛子挤压了它们,结果得到了微弱的发光浆液。通过与成千上万的海ly一起这样做,Shimomura的努力得到了化学发光蛋白水母发光蛋白[aequorin [2]。后来发现,水母发光蛋白负责蓝光的发射,这是由于它作为萤光素酶在钙依赖性反应中腔肠素的氧化中的作用。萤光素酶是在化学反应中与光发射相关的氧化其底物(萤光素)的酶。

图1:2,维多利亚水母水母。资料来源:Ssblakely,通过Wikimedia Commons

但是,仍然存在一个令人困惑的问题,为什么完整的有机体发出绿色的光时提取物中会发出蓝光? Shimomura和他的同事花了几年时间解决了这个谜。但最终他们的研究表明,来自水母发光蛋白的蓝光只是另一种闪闪发光的蛋白质(水母绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)。他们意识到水母发光蛋白发出的光被 绿色荧光蛋白 利用这种能量产生绿色荧光。

凯旋游行的下一个突破性步骤 绿色荧光蛋白 不得不等待1970年代克隆技术的发明。美国微生物学家道格拉斯·普拉舍(Douglas Prasher)的工作克隆了完整的 绿色荧光蛋白 该基因于1992年首次出现[3]。在他与佐治亚大学的同事Milton Cormier一起准备A. victoria cDNA文库之前,他已经知道 绿色荧光蛋白。不幸的是,在他开始表达重组体之前,美国癌症协会的Prashers资金用尽了 绿色荧光蛋白 在细菌中。

最初怀疑 绿色荧光蛋白 美国生物学家马丁·查尔菲(Martin Chalfie)消除了在水母之外工作的可能性,他可以从普拉舍尔(Prasher)的初步研究中受益。通过介绍 绿色荧光蛋白 基因可以进入大肠杆菌和线虫秀丽隐杆线虫,他可以证明没有其他水母特异性蛋白质或产生绿光的必要因子[4]。

活细胞成像中的GFP

有了这些经验,绿色荧光蛋白的大门就打开了,开始了其在生命科学领域的惊人职业。 绿色荧光蛋白 无需合成标记或荧光抗体即可成为观察活细胞和生物体结构的关键。在免疫荧光染色的情况下,必须确保抗体进入细胞内的相应靶结构。这是通过用去污剂(例如)透化细胞来实现的,所述去污剂不可避免地诱导细胞死亡。此外,大多数抗体都倾向于变性抗原。因此,免疫荧光技术使用诸如对甲醛的试剂来变性细胞蛋白靶结构。总共使用 绿色荧光蛋白 可以克服这些非生理条件,并为生命细胞成像铺平道路。

另一个正在意识到和发展潜力巨大的人 绿色荧光蛋白 是钱国强。来自钙调节领域的美国细胞生物学家对跟踪活细胞内部的大分子相互作用越来越感兴趣。在哈佛,剑桥和伯克利学习和工作之后,他终于在加利福尼亚大学圣地亚哥分校定居。作为药理学,化学和生物化学教授,他提高了 绿色荧光蛋白 通过利用进化中非常普遍的原理:突变。 1994年,他和他的小组建立了一个单点突变体(S65T), 绿色荧光蛋白 具有比野生型更好的强度和光稳定性。除了发出更明亮的光芒,S65T突变体还具有另一个惊人的技术优势。而野生型 绿色荧光蛋白 在395 nm和475 nm处有两个激发最大值,突变版本在484 nm处只有一个激发最大值 纳米通过保持其发射波长为509 nm的光谱特征"new" 绿色荧光蛋白 几乎适合古典 FITC 荧光特性(FITCex:496 nm, FITCem: 520–530 nm)。由于其增强功能, 绿色荧光蛋白 变体被称为“增强” 绿色荧光蛋白 或EGFP。

通过对 绿色荧光蛋白 Tsien及其同事开发了进一步的荧光衍生物。随着 绿色荧光蛋白 他们手中构造了一种变体(T203Y),它的颜色呈亮黄色,因此命名为"黄色荧光蛋白"或YFP。青色(CFP)和蓝色(BFP)格式后跟[5]。

疟原虫中的荧光蛋白

生物化学家谢尔盖·A·卢克亚诺夫(Sergey A. Lukyanov)自2003年以来一直是俄罗斯科学院的一员,他在珊瑚中发现了红色的荧光蛋白,因此荧光蛋白的调色板扩展到了光谱的红色范围。7]。在莫斯科一家宠物商店里购买了一些刺五加后,卢克亚诺夫研究了这些注定要运往俄罗斯海洋水族馆的原始动物的荧光行为。除其他外,他鉴定了一种来自Discosoma的红色荧光蛋白-Corallimorpharia-他称之为DsRed。除了DsRed之外,Lukyanov及其同事还鉴定出了按蚊(Anthozoa)中其他发光蛋白质的完整调色板,这些蛋白质针对生物化学的使用而不断优化。

The Nobel Prize

在发现,理解和增强荧光蛋白方面的所有努力研究导致了在生命科学中的广泛应用。 绿色荧光蛋白 其变体为科学家观看f.e.活生物体内转移或血管生成。此外,使用荧光彩色神经元(Brainbow)将有助于了解大脑中复杂的神经元网络。由于可以用荧光蛋白修饰疟原虫,恶性疟原虫等寄生虫,因此有可能在宿主细胞中观察其命运。机会清单几乎可以无限延续,不仅包括临床相关项目,还包括其他基础科学事业。

一起使用 绿色荧光蛋白 它的突变体以戏剧性的方式改变了我们对生命及其病理学改变的看法,三个人参与了发现和发展 绿色荧光蛋白 他们获得了2008年诺贝尔化学奖。 下村治, 马丁·查尔菲 因在研究上的杰出贡献而被授予最高科学荣誉"绿色荧光蛋白的发现和发展, 绿色荧光蛋白".

www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/

在诺贝尔化学委员会(2008)的眼里,以MånsEhrenberg教授为代表"…绿色荧光蛋白的发现与开发( 绿色荧光蛋白)从根本上改变了科学议程。改进的 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白高分辨率的显微镜,计算技术和强大的理论方法协同作用产生类似蛋白质的蛋白质,目前正在推动着重于对复杂生物系统进行定量分析的科学革命。迄今为止从未见过的结构和动力学原理世界的逐渐出现,实际上已经影响着生物学,医学和制药研究的各个方面……"

引用2008年诺贝尔化学奖的演讲时的话再一次代表了荧光蛋白对当前生命科学的巨大影响,也引起了我们对未来未来应用的好奇心。荧光笔蛋白(可光激活,可光切换或可光转换的FP)等最新发展以及超分辨率显微镜等新光学设施的建立表明,荧光的发展仍在进行中,并且还远远没有结束。