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绿色荧光蛋白(GFP)的分子结构
绿色荧光蛋白(GFP)的分子结构
讲解

荧光蛋白–简介和光谱特征

随着1950年代荧光蛋白的发现,荧光显微镜的前景发生了巨大变化。起点是检测水母 水母 维多利亚 绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)由 下村。几百个 绿色荧光蛋白 突变后,荧光蛋白的范围从蓝色到红色光谱。来自其他物种(如疟原虫)的更多荧光蛋白的出现将发射波长甚至转移到了远红色区域。这种可能性为寻找满足其要求的荧光蛋白标签的科学家提供了绝佳的选择。本文概述了最新的替代方案,并提供了一个具有所有相关光谱特征的清晰表。

绿色荧光蛋白(GFP)的分子结构

s

主题 & 标签

来自的荧光蛋白 维多利亚

的光谱性质 绿色荧光蛋白 或其变体位于形成 发色团 (图1)。这可以是65-67位的三个氨基酸或靠近该位置的残基(例如YFP)。除了涉及发色团的主要突变外,还进行了其他定点诱变研究,以改善其他因素,例如蛋白质成熟和在异源细胞系统中的表达(例如密码子使用,在生理温度下蛋白质折叠)。注意 维多利亚 是没有身体加热系统的相对原始的海洋生物。

即使 绿色荧光蛋白 由于其亮度和高光稳定性,它是最受欢迎的FP之一,它有两个主要缺点。这些对pH有一定的敏感性,并且有轻微的二聚趋势。 二聚化 要么 低聚 是许多FP的问题。它们偏爱彼此凝集会产生与融合蛋白的位置和功能有关的伪影或误解。但是科学家们也为这个问题提出了一些答案。非极性氨基酸被亲水性氨基酸取代的关键位置(F223R,L221K和A206K)的突变显示出二聚化降低。导致光谱和实用特性改善的所有遗传变化均归纳为"enhanced" FPs.

对于wtGFP,增强会导致 绿色荧光蛋白 (增强 绿色荧光蛋白)在488处有一个激发峰 而不是先前的395处的复吸收光谱 nm 和 475 纳米Roger Tsien等人开发的wtGFP的第一个突变版本(S65T突变体)。比原先的亮度高五倍,并显示出较短的成熟度 时间。基于另一个突变(F64L),再加上在37°C时更好的成熟效率,这对于看活细胞的人们起着重要的作用。

一个非常有趣的 绿色荧光蛋白 最大斯托克斯班次之一的变体是 蓝宝石。靠近发色团(T203I)的位置发生突变会导致最大激发值更改为399 nm和最大发射到511 纳米这是112的斯托克斯移位 nm. 是另一个 绿色荧光蛋白 改进的光稳定性和亮度,以及在哺乳动物细胞中更有效的折叠。

尽管所有绿色荧光蛋白都具有相对较高的亮度,但蓝色荧光蛋白通常在显微应用中会降低发射强度。然而,由于其他光谱特性,它们被用于光学测定。 EBFP (增强的蓝色荧光蛋白)是通过几轮wtGFP突变构建的。第一个(Y66H)将发射峰从绿色光谱跳过到蓝色光谱。随后发生了更多的突变,产生了一个最大激发波长为380的蛋白质 nm,最大发射为448 纳米这些光谱特性使其成为EGFP的合作伙伴 烦恼 显微镜检查。最近的蓝色荧光蛋白具有更高的量子产率和更好的光稳定性。 石青石, SBFP2EBFP2。有前途的EBFP继任者是一种名为 天狼星 由于其对pH的极高耐受性(在pH 3–9稳定)以及以迄今发射波长最短的荧光蛋白而享有盛誉而广受欢迎。

第二类“蓝色” 绿色荧光蛋白 变体由青色荧光蛋白形成: CFP。酪氨酸被色氨酸(Y66W)取代以及进一步的遗传改变导致荧光染料的亮度和光稳定性提高。该ECFP在433/445处具有双峰激发和发射光谱 nm 和 475/503 纳米亮度只有40 EGFP的百分比。 ECFP的一个主要变体是 蔚蓝,具有更高的消光系数和量子产率。它的亮度是ECFP的1.5倍,可用作 烦恼 与YFP合作。

A 绿色荧光蛋白 不直接改变生色团中三个中心氨基酸之一的突变导致黄色荧光蛋白的增加。 YFP 在第203位具有一个通用的苏氨酸,可通过酪氨酸(T203Y)进行交换。该氨基酸是β-桶的一部分,紧邻发色团。相比 绿色荧光蛋白,激发和发射特性已移至更长的波长,激发和发射最大值为514 nm 和 527 nm(EYFP)。 眼动计划的一项特性是其pH敏感性。在pH 6.5时EYFP仅具有约50 %的荧光,这并不总是不利的。当进行pH测量时(例如囊泡,内体等),EYFP可用作指示剂。有趣的是,进一步的突变(Q69M)具有更好的酸稳定性并显着提高了亮度(75 比EGFP亮%)。与EGFP相比,这种蛋白质的光稳定性仍然较差,被称为 茶晶。另一个YFP突变体(F46L)显示出更快的成熟速度,并且还提高了pH耐受性。 这种蛋白质被命名为 金星 并且经常 烦恼 与天蓝的接受者。

拟花虫的荧光蛋白

从第一部分可以看出,大多数FP都来自水母 维多利亚 发出蓝色到黄色光谱的光。缺少红色荧光蛋白。俄罗斯科学家 谢尔盖·卢基亚诺夫(Sergey A.Lukyanov) 当他在Anthozoa发现FP时,填补了这一空白。红色FP具有比其他FP更大的优势,因为红色光谱中的细胞自发荧光更少。此外,它们被更长的波长激发,这对于活细胞是有益的。较短波长的光对标本的损害更大。珊瑚蛋白相对于水母蛋白的另一个一般优势是它们在37°C时有效成熟。鉴于 维多利亚 绿色荧光蛋白 并且必须对其衍生物进行正确的基因折叠以使其折叠,从而使花椒蛋白成熟,而无需进行分子工程改造。这可能是由于其生物群落的水温升高。

在Anthozoa中发现的第一个也是最常用的FP是 红色。这个名字来自海葵 纹线虫。 红色的最大激发值为558 nm和发射峰在583 纳米但是,当结构信息发布时,第一次欣喜就停滞了。 红色的成熟速度比水母FP慢得多,并且具有中等生色团阶段。该阶段发射绿色光谱的光,并导致与其他FP重叠。如前所述 绿色荧光蛋白 部分中,DsRed也有另一个问题。发出红色荧光的海葵蛋白是专性四聚体,易形成寡聚体。这可能导致对融合蛋白的位置和功能的误解。总的来说,花虫FP具有与水母FP相似的结构。发色团隐藏在大小为4的β桶结构中 nm x 3 nm(高度x直径)。不同之处在于,Anthozoaβ-barrel的外观更呈椭圆形(图2)。

平行于 绿色荧光蛋白 "evolution",研究人员开始修改原始的DsRed以克服其结构缺陷。第二代DsRed – 红色2 –降低了低聚物的形成趋势,并加快了成熟速度,从而最大程度地减少了发射绿色光的中间阶段。进一步的诱变导致红色FP完全失去其四聚体状态,但也丧失了部分量子产率(25 DsRed2的百分比)。钱等人的这项工作。是第一个单体红色荧光蛋白,因此被称为 mRFP1.

然后,此mRFP1是创建一组六种单体FP的起点,这些单体统称为 "mFruit"。它们的个人名称来自其发射色:mHoneydew,mBanana,mOrange,mTangerine,mStrawberry和mCherry。 mCherry 是这些FP中最有用的,发出610范围内的光 50 nm的亮度 % that of 绿色荧光蛋白.

到目前为止,最聪明的FP是mFruit派系的追随者,其名称为 td番茄。就基因改变而言,dTomato是专性二聚体。但是通过将两个二聚体伴侣放在一个分子中可以避免二聚体。两个dTomato单元通过一个12个氨基酸的连接基偶联,形成了串联二聚体FP td番茄,其最大发射在581 nm处,并且在最高区域具有光稳定性。

发射光谱进一步移到了远红色区域(630 nm – 700 纳米)创建另一个mFruit继任者。 梅花 是649个mFruit蛋白质中红色发射最深的mFruit成员 nm.

科学使用的绿色荧光花青蛋白的数量非常少,考虑到众所周知和用户友好的可用性,这并不奇怪 维多利亚 绿色荧光蛋白。显然,人们没有必要建立新的绿色荧光蛋白。尽管如此,还是有一些,比如石珊瑚中的一种明亮的荧光蛋白。 银河科, Azami Green。有趣的是,它与EGFP的序列同源性小于6 %.

对深部组织成像有很大影响的花粉虫FP 卡图什卡。将诱变应用于来自的RFP 四色大肠杆菌,Katushka被鉴定为二聚体蛋白,最大发射量为635 nm和所有深红色荧光蛋白的最高亮度水平。 卡图什卡的单体形式称为 凯特 并且后来提供了更高的亮度,导致 凯特2.

总而言之,今天用于显微应用的所有荧光蛋白均来自原始海洋生物。表 图1包括最重要的光谱及其相关的光谱特征,例如激发和发射最大值,光稳定性,量子产率和亮度。

Outlook

事实证明,一个非常有趣的故事是发现了脊椎动物表达的FP。 Amphioxus是一种像鱼一样的小型海洋藻类,可产生 荧光蛋白 在它的前侧。该FP的序列分析预测了典型的β-桶结构,似乎与 绿色荧光蛋白 the足类的 蓬蓬 (甲壳纲)。这一发现表明,荧光现象不仅限于原始无脊椎动物,而且还可以在进化阶段较高的动物中发现。此外,该发现显示了荧光蛋白的发现,操纵和增强的持续过程,这仍然是研究人员的热门话题。这一事实证实了荧光蛋白在最近和将来的生命科学研究中的重要性和高影响力。

荧光蛋白的光谱特征

表1:荧光蛋白,来源: http://flowcyt.salk.edu/fluo.html
例如:峰值激发波长(nm)
Em:峰值发射波长(nm)
兆瓦:分子量
Y :量子产率
BR:亮度;消光系数*量子产率/ 1,000
聚苯乙烯:光稳定性;时间到50 % brightness (sec)

荧光蛋白

防爆(nm)

Em(nm)

兆瓦

Y

BR

聚苯乙烯

资源

其他

Y66H

360

442

Y66F

360

508

EBFP

380

440

0.18

9

Addgene

单体

EBFP2

383

448

0.56

18

Addgene

单体

石青石

383

447

0.55

14

单体

绿色荧光蛋白

385

508

蓝宝石

399

511

0.60

26

25

弱二聚体

TagBFP

402

457

26 k

0.63

33

++

雌激素

单体

蔚蓝

433

475

0.62

27

36

弱二聚体

流式细胞仪

433

475

0.40

13

64

单体

ECFP

434

477

0.15

3

赛宝

435

477

0.51

18

59

弱二聚体

Y66W

436

485

凯玛红

440

616

0.31

8

MBL

二聚体

mKeima-红色

440

620

0.24

3

MBL

单体

标签CFP

458

480

0.57

29

雌激素

二聚体

AmCyan1

458

489

0.75

29

克隆泰克

四聚体

mTFP1(蓝绿色)

462

492

0.85

54

二聚体

S65A

471

504

绿石青

472

495

0.9

25

MBL

二聚体

野生型 绿色荧光蛋白

396,475

508

26 k

0.77

16

S65C

479

507

TurboGFP

482

502

26 k

0.53

37

雌激素

二聚体

标签GFP

482

505

27 k

0.59

34

++

雌激素

单体

标签GFP2

483

506

27 k

0.6

34

++

雌激素

单体

AcGFP1

484

510

27 k

0.82

27

克隆泰克

S65L

484

510

487

509

0.68

39

0.69

英杰

弱二聚体

S65T

488

511

绿色荧光蛋白

488

507

26 k

0.60

34

174

Addgene

弱二聚体

Azami-Green

492

505

0.74

41

MBL

四聚体(可用单体)

ZsGreen1

493

505

105 k

0.91

40

克隆泰克

四聚体

德龙帕·格林

503

518

0.85

81

MBL

光开关

标签YFP

508

524

27 k

0.62

47

雌激素

单体

眼动计划

514

527

26 k

0.61

51

60

弱二聚体

黄玉

514

527

0.60

57

单体

金星

515

528

0.57

53

15

弱二聚体

柠檬黄素

516

529

0.76

59

49

单体

>YPet

517

530

0.77

80

49

弱二聚体

TurboYFP

525

538

26 k

0.53

56

雌激素

二聚体

苯丙氨酸

525

537

26.8 k

0.40

52

++

雌激素

弱二聚体

苯丙氨酸甲酯

525

537

26.8 k

0.39

48

++

雌激素

单体

ZsYellow1

529

539

0.65

13

克隆泰克

四聚体

香蕉

540

553

0.70

4

克隆泰克

单体

Kusabira-Orange

548

559

0.60

31

MBL

单体

橙色

548

562

0.69

49

9

单体

橙2

549

565

0.60

35

克隆泰克

单体

mKO

548

559

0.60

31

122

单体

TurboRFP

553

574

26 k

0.67

62

雌激素

二聚体

td番茄

554

581

0.69

95

98

克隆泰克

串联二聚体

红色-Express2

554

591

0.42

15

克隆泰克

标签RFP

555

584

27 k

0.48

48

雌激素

单体

红色单体

557

592

〜28 k

0.1

3.5

16

克隆泰克

单体

红色2("RFP")

563

582

〜110 k

0.55

24

克隆泰克

草莓

574

596

0.29

26

15

克隆泰克

单体

TurboFP602

574

602

26 k

0.35

26

雌激素

二聚体

AsRed2

576

592

〜110 k

0.21

13

克隆泰克

四聚体

mRFP1

584

607

〜30 k

0.25

钱实验室

单体

红色

584

610

0.20

8.8

13

二聚体

mCherry

587

610

0.22

16

96

克隆泰克

单体

HcRed1

588

618

〜52 k

0.03

0.6

克隆泰克

二聚体

凯特2

588

633

26 k

0.40

25

+

雌激素

单体

卡图什卡 (TurboFP635)

588

635

26 k

0.34

22

++

雌激素

二聚体

凯特 (TagFP635)

588

635

0.30

15

雌激素

单体

TurboFP635

588

635

26 k

0.34

22

雌激素

二聚体

梅花

590

649

0.10

4.1

53

克隆泰克

树莓

598

625

0.15

13

克隆泰克

单体;比mPlum更快的光漂白

海王星

600

650

0.20

13

钱实验室

单体

E2-深红色

611

646

0.23

29

克隆泰克