荧光显微镜的后一体主义时代：分子，细胞和组织
在这种变化过程中深入研究了肿瘤学研究，识别完全基于的无菌方法的风险 体外 楷模。靶向特定分子的治疗需要实现a 特质d'联盟 从单分子生化结构分析开始并在细胞环境中延伸到它们在细胞环境中的作用。分析的情况随后从克隆肿瘤群中的群体从肿瘤和宿主之间建立的复杂相互作用网络从组织活组织检查中检查，然后在活动物模型中。
现代光学显微镜始终代表生物医学研究的不可或缺的工具，并开发了适应通过实验方法所针对的样本的大异质性决定的不断变化的要求。除了逐渐提高分辨率的情况下，光学显微镜现在必须从单细胞扩展其非侵入性分析能力，以使在观察步骤中最小化对生命的干扰。
多光电激发显微镜的革命代表了朝向复杂生活系统的观察的一步[1]。红外线高频源提供无与伦比的穿透深度。能够容易地诱导荧光 紫外线 已成功用于监测代谢和结构标志物的浓度和功能的激发分子 in vivo，例如NADH和胶原蛋白。开发的测定支持纺酚显微镜在临床试验中的先驱参与，以实现皮肤肿瘤诊断中的“光学活检”的第一种方法[2]。
现代显微镜最相关和成功的变换之一是能够与开发用于确定功能参数的新测定的仪器改性。除了纳米镜的新兴领域，其特征在于4pi的诞生和 st 显微镜允许在光学和电子显微镜下减少空间分辨率的间隙，我们对单分子物种的性质的见解，从新功能显微镜测定和技术的诞生中获得了相关优势。这个过程中的重新发现了"F Techniques"，光漂白后荧光恢复（Frap.），荧光共振能量转移（烦恼）和荧光相关光谱（ FCS. ）用于研究分子动力学和相互作用。
在下文中，我们将重点关注特定应用，提供了一些方法"standard"共聚焦显微镜可以在阳性研究中，在营养水平的复杂程度上。从单分子分子的性质开始，我们将转向它们在生活细胞生化网络中的作用，从静态均匀的样品中缩放（体外 细胞培养群体）组织学分析的内在异质性。
图1：光漂白后的体外荧光回收，用于化学反应动力学表征（由穆斯卡基奥，vink的礼貌。答：化学二元系统中的组分浓度的时间演变是通过在适当的实验条件下具有直接分析溶液的微分方程的模拟。将两个物种中的一种固定在表面（盖玻片，琼脂糖珠粒）上，而另一个物种与荧光分子共价标记。复合物的形成伴随着盖玻片上的荧光信号的积累。根据溶液中配体的浓度，通过关联和解离速率统治荧光强度的时间行为。 B：与化学动力学相比，通过在无重构和快速扩散的假设下，通过解离速率完全统治表面后的荧光恢复。半恢复时间与所研究的分子复合物的半衰期一致。 C：图表报告了荧光信号强度的演变。第一阶段的特征在于达到化学均衡。之后，将表面上的复合物漂白并观察到恢复。因此可以理解两个阶段的不同时间行为。
分子：功能纳米镜。化学反应动力学的特征
复杂生物化网络的研究从简化的实验模型开始 体外 由纯化的生物分子构成的二元系统。到目前为止，通过基于等温热量法和/或表面等离子体共振的仪器获得了化学反应动力学参数的测量，具有高获取和维护成本。
共聚焦显微镜，特别是光漂白后的荧光恢复（Frap.）方案可以在最近在纸上发表的有效替代方案，就纸上的分子机制表征"主轴汇编检查点" [3]。在 Frap. 方案光博用于在靶区域内失活荧光分子。分子迁移率通过替换漂白的荧光分子来恢复荧光信号。信号恢复的速度表示由分子在植物（不同的细胞室）和与其他分子物种的相互作用所在的环境中的扩散系数确定的分子迁移率指数。当单个分子物质固定在表面上并暴露于在溶液中荧光标记的第二相互作用分子中时，将检测发射信号的增加，直到达到化学平衡（图1）。
强度的时间演变将通过与系统中反应物的浓度成比例地统治和解率。然而，上述表面的光漂白区域中的荧光的恢复将不再取决于这些参数。在适当的假设下，即扩散过程比化学反应快得多，替代漂白分子的限制步骤是现有复合物的拆卸。因此，半恢复时间与所研究的分子复合物的半衰期一致。荧光时间演进图的比较显示了两种过程的动力学的差异：达到化学均衡的达到更快的时间尺度，而光截面没有打扰所获得的化学平衡，因此由半衰期排除出来现有的复合体。
蜂窝网络：突出分子通量
生活细胞提供了验证的完美目标 Frap. 协议。通过完美程度的空间和时间间隔，实现机制的协调。除了 Frap. 技术，我们遵循分子运动的能力随着荧光蛋白的光活泼/光可交易变体的克隆而获得了显着的优势。选择性地接触荧光的可能性，产生高度局部化的信噪比，在生物细胞和生物中具有极大促进的分子和细胞跟踪。基于共聚焦显微镜的光漂白/去活化协议的强烈限制导出无法控制目标体积的深度：聚焦高斯激光束将基本上提供足够的高能量密度，足以采用跨越目标跨度照明锥内的照相/光冻分子超过几微米。
使用本质上有限的激励的光学设定敞开了三维光电转换过程的方式[4, 5 ]。全内反射荧光显微镜（Tirf.）能够在跨越几百纳米的细胞区域上将分子采用基础膜，采用由在具有不同光学性质的两个介质之间的界面处产生的延长电磁场，即玻璃盖玻璃和细胞膜。双光子显微镜能够在电池内部移动，靶向速度为衍射有限的程度。在三维中限制活性体积的可能性为生活细胞分析中的一些具有挑战性的问题提供了新的工具。可以成功地使用具有上下膜的内吞囊泡的内吞囊泡的靶向光痉挛，仅可行，只能成功地用于证明存在从细胞质向细胞膜引导的分子量的存在。
组织：三维共焦组织病理学
典型的组织学分析已经基于光学显微镜的岁月，仅在荧光显微镜视野下略微进入。 现代共聚焦显微镜的演变，特别是谱检测系统的诞生，高自动化程度和非线性激发旋转最近刺激和加强激光扫描共聚焦显微镜与组织学分析之间的相互作用[6]。组织病理学样品代表了在后一体旋转所需的分析材料的复杂性中重新扫描的第一步。这种复杂性将材料的丰富性转化为光传播的硬环境。在分析这种复杂的样品时，浅色可用于分析这些复杂的样品，即光谱折叠卷积。测量光物理特征 他分析的材料可以帮助了解组织成分，并在高含量分析中建立最佳荧光团组合以最大化分析参数。
下一步骤包括获得衍射有限观察，以确定在极宽的视野上确定细胞内参数，以允许识别组织组织的独特性截面。实现这种具有挑战性的任务需要一种马赛克方法，可以通过使用自动阶段或通过智能使用共聚焦显微镜的扫描镜来利用。已经采用这种方法来测量从正常人类肠道中的不同组织学室中的暴露细胞白血病蛋白核体的大小分布（图3）。视野（360×360μm2通过将16种不同的面板与约80nm的采样像素合并收集的16种不同的面板获得。这种分析表明细胞内性质和组织学分区之间的相关性。 体外 研究归因于PML一种抗增殖效应。肠土地区的PML核体的平均尺寸和强度低于周围结缔组织中计算的值，表明蛋白质含量和增殖之间的相关性，隐窝是高复制活性的位点。
References
- DiaSpro A.等.:多光子激发显微镜。 BioMed Eng在线5（2006）36。
- KONIG K.等.:临床双光子微观镜检查。 Microsc Res Tech 70（2007）398-402。
- Vink M.等人：体外FRAP识别Mad2 Kinetochore动态的最小要求。 Curr Biol 16（2006）755-66。
- DIAAPRO A等：使用双光子相互作用的活细胞中PA-GFP的3D局部局部光激活。 Conf Proc Ieee Eng Med Biol SoC 1（2006）389-91。
- Schneider M，Barozzi S，Testa I，Faretta M，DiaSpro A：在720-920-nm区域中PA-GFP的双光子活化和激发性能。 Biophys J 89（2005）1346-52。
- Transidico P，Bianchi M，Capra M，Pelicci Pg，Faretta M：从细胞到组织：荧光共聚焦显微镜在组织学样品研究中。 Microsc Res Tech 64（2004）89-95。