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CRISPR技术 / 卡斯9基因编辑-基因组工程的突破

CRISPR技术 / 卡斯9系统是防御病毒攻击的几种不同细菌系统之一。它由两个主要部分组成。一个是一小段RNA,可通过Watson-Crick碱基配对与病毒靶序列结合。它用作外源核酸的标记。

第二个成分是Cas9蛋白。它与标记的序列结合并由于其核酸酶活性而被切割。由于碱基配对RNA可以轻松合成,然后用于确定目标区域,因此研究人员已在实验室中将该系统用于基因组编辑。

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江苏体彩双链断裂诱导基因编辑

自从1950年代发现江苏体彩以来,研究人员致力于了解这种普遍的生活准则。一方面,基础科学想破译基本现象和机理。另一方面,诸如生物技术或医学之类的应用科学试图利用这些信息来创造更健壮的农作物或治愈疾病。

所有对江苏体彩及其相关表型感兴趣的研究人员的常用方法是 修改。为了找出某个基因及其相应蛋白质的作用(通过基因表达),一个明显的策略是摆脱它(敲除)或修饰它(突变)并观察结果。这个目标就是为什么多年来开发了几种技术来改变基因组信息的原因。

利用细菌衍生 限制酶 (EcoRI, BamHI, 后三 等)在特定位点切割江苏体彩是基因改变方法的一个例子。这些酶用于分子克隆,即融合重组江苏体彩以在宿主生物中表达。每个限制酶只有一个可以切割的特定江苏体彩序列。 Ligas将目标江苏体彩片段融合成一个 质粒载体。克隆过程在体外进行,重组江苏体彩质粒必须转移回细胞中以产生相关蛋白。

由于发现了内源性基因,因此开发了一种以内源状态(即直接在靶细胞的内在基因组中)操纵基因的方法。 同源重组 (HR)。可以利用序列同源性将外源江苏体彩片段引入靶基因组。在少数情况下,与目标序列具有同源性的江苏体彩片段可通过重组整合到基因组中(十分之一)6-109 细胞)。这一发现促进了诸如敲入(添加一个或多个基因)和敲除动物等事物的创建。

尽管取得了这些进步,但同源重组这一罕见事件仍需要改进。幸运的是,出现了更多操纵江苏体彩的方法。发现另一种核酸切割酶– 核酸酶 –可以被编程并用于基因操作。最初,开发了三种主要的蛋白质类别。 大范围核酸酶 来自细菌, 锌指核酸酶(ZFN) 基于真核转录因子,和 转录激活子样效应子核酸酶(人才) 来自细菌的细菌都通过蛋白质-江苏体彩相互作用识别其江苏体彩结合位点。大范围核酸酶本身具有江苏体彩结合结构域和核酸酶结构域,而ZF和TALE附着于FokI核酸酶结构域。

原则上,基于大范围核酸酶,ZFN或TALEN的基因组编辑技术也使用同源重组来引入一段外源江苏体彩,但它们不会等待双链断裂偶然发生。由于其序列特异性和核酸酶活性,它们能够产生靶向的江苏体彩双链断裂(DSB)为特定于基因座的同源重组创造空间。

现在更详细地讲,江苏体彩双链断裂后可能发生两种机制。两者都是内源性江苏体彩修复机制的一部分,并取决于是否存在适当的同源性修复模板(见图1):

一种) 非同源末端连接 (NHEJ)会在没有外源同源修复模板的情况下发生,并且可能会引入插入或缺失(indels),最终导致移码突变或基因敲除。

B) 同源性修复 如果有外源修复模板(例如,受操纵的基因)可用,并且可以通过产生精确基因修饰的修复机制将其插入到打开的江苏体彩链中,则会发生(HDR)。

CRISPR / 卡斯细菌免疫系统

CRISPR技术 / 卡斯系统于1980年代首次发现,当时研究人员仔细研究了细菌的基因组。最初研究某些酶后,他们发现了靶基因序列下游的重复元件。这些重复元素又被非重复序列隔开。随着越来越多的基因组测序,结果证明这些间隔重复的重复序列在整个细菌和古细菌的基因组中都是保守的,这表明这可能很重要。由于其特性,它们被称为簇状规则间隔的短回文重复序列或 CRISPR技术.

下一个决定性发现是在2005年,当时对重复元件之间的间隔子进行了分析,发现它们是细菌外起源。相反,它们属于噬菌体(病毒)的基因组。然后发生了一个有趣的启示:带有某些噬菌体江苏体彩元素的细菌不再能被它们感染。该结果得出的结论是,新发现的遗传元件可能属于复杂的原核免疫系统(见图2)。

随后的研究证明了这一理论是正确的,并发现存在几种不同的基于CRISPR的系统,这些系统最终都导致病毒江苏体彩和RNA的降解。 CRISPR技术的基本原理是将外源江苏体彩片段整合到细菌基因组中,并将其转录本用作碱基配对诱导的病毒江苏体彩结合和销毁所有未来感染的基质。 CRISPR技术机制的更详细描述如下。

细菌细胞的感染始于噬菌体,其表面对接,将其遗传物质释放到细菌中(见图3)。同时,表达了CRISPR基因座上游的一些基因。由于它们的位置和功能,它们被称为CRISPR相关基因或简称 卡斯。他们的基因产物能够从外源江苏体彩中切割出不同的片段,这称为 原型垫片。随后,将原间隔子作为江苏体彩序列间隔子插入CRISPR基因座。

CRISPR技术基因座的转录导致由许多间隔子和重复序列组成的pre-crRNA,随后将其加工。然后,成熟的crRNA仅包含一个重复序列和一个间隔区,可以被不同的CRISPR / 卡斯系统用于通过Watson-Crick碱基配对靶向外源江苏体彩。 I型,III型和IV型系统由大量的Cas蛋白复合物组成,而II型(即Cas9)和V型(即Cpf1)系统仅由单个蛋白组成 江苏体彩靶向分裂。除crRNA外,Cas9系统还包含另一个短链RNA,称为tracrRNA(反式激活crRNA),它与crRNA的间隔区杂交。

所有CRISPR / 卡斯系统的最终结果是相同的:crRNA指导Cas蛋白与同源片段的结合后,外源江苏体彩被降解。细菌CRISPR基因座内部的间隔区与病毒江苏体彩的序列相同,这一事实提出了一个问题:为什么Cas蛋白不能识别细菌江苏体彩中的间隔区?

奇怪的是,对于系统I和II,存在一种区分自我和非自我的机制。 卡斯蛋白需要一个所谓的 PAM (与前间隔物相邻的基序)一旦与病毒江苏体彩链结合便能够有效发挥功能。根据生物体的不同,PAM的顺序可能会有所不同。一种源自 化脓性链球菌 是5'-NGG-3',其中"N"是任何核碱基,"G"是鸟嘌呤。因为在获得的病毒基因摘录(间隔子)两侧的CRISPR基因座中的直接重复序列没有PAM,所以Cas9蛋白不会在那里结合。由于感染,它仅与入侵的病毒江苏体彩结合。换句话说,在PAM的帮助下,CRIPSR基因座受到保护,不会自我破坏。

有关CRISPR / 卡斯起源的更多信息,请观看 视频讲座:CRISPR-Cas –从细菌自适应免疫系统到基因组工程工具.

使用Cas9进行基因编辑

来自细菌II型CRISPR / 卡斯系统的Cas9核酸酶可用于基因组编辑。这意味着它能够引入外源基因或干扰内源基因。借助此类实验,研究人员可以发现某些基因及其各自表达的蛋白质的作用。而且,他们可以编辑基因组以修饰生物,以达到有益的目的,例如,更健壮,更容易种植的作物。

在此类试验过程中,通常会使用显微镜进行标本制备(例如细胞培养工作)或观察转基因细胞或生物的表型。

卡斯9 基因编辑系统遵循与大范围核酸酶,ZFN或TALEN相同的原理:Cas9核酸酶能够在特定位点切割江苏体彩链并将其切割以产生双链断裂,使其易于受上述江苏体彩修复机制的影响(参见图4)。 卡斯9与现有的三种基因组编辑工具之间的最大区别在于,Cas9使用一块RNA进行江苏体彩靶向。这个事实非常有利,因为所谓的 sgRNA (单向导RNA)可以很容易地合成。代替以费力的方式设计江苏体彩结合蛋白,可以通过PCR快速合成sgRNA(对应于宿主江苏体彩序列)。

sgRNA可追溯到原始CRISPR / 卡斯9系统的crRNA和tracrRNA。为了简化,通过引入环将crRNA和tracrRNA融合,产生sgRNA。

但是,Cas9系统也有一个缺点。如上所述,Cas9核酸酶需要一个 PAM (与Protospacer相邻的基序)与目标江苏体彩序列(3'末端)非常接近,或者它无法有效发挥作用,因此在一定程度上限制了其基因编辑潜力。

因此,为了将Cas9用作基因编辑工具,只能修改3'端侧接PAM的江苏体彩序列。例如,上述5'-NGG-3'PAM可使人类基因组平均每8个碱基对进行一次编辑。 化脓性链球菌 派生Cas9(SpCas9)。但是,其他物种的Cas9蛋白,例如 嗜热链球菌 要么 脑膜炎奈瑟菌,还有其他PAM,这反过来又扩展了Cas9工具箱的定位范围。

对Cas9系统的最大兴趣在于可以将其用于 多重编辑 在哺乳动物细胞中,即通过添加几种sgRNA同时编辑不同的靶位点。下表1列出了Cas9系统的其他优点和缺点。

 

大范围核酸酶

锌指核酸酶

塔伦

CRISPR技术 / 卡斯9

江苏体彩结合分子

蛋白

蛋白

蛋白

核糖核酸

起源

真核生物

细菌/古细菌

优点& Cons

-少数适合靶江苏体彩序列的合适的大范围核酸酶蛋白残基

-努力修改

-由江苏体彩结合蛋白的模块化阵列组成

-它们之间的串扰影响序列特异性

-需要大量筛选

-努力修改

-对于ZFN,模块化构造可能会遇到上下文相关的特异性

- 劳动密集型

+易于修改

+快速生产  of sgRNA

+高度可定制

+多目标(多路复用)

-在目标位置需要PAM序列

表1:基因组编辑工具的事实,优点和缺点。

Cas9系统的应用

为了将两个分子Cas9和sgRNA传递到靶细胞中,有多种策略。

编辑 细胞培养 系可以通过质粒转化来完成。两个元素都被编码在相同的向量上,或者被编码在两个单独的向量上。当计划插入或替换时,供体江苏体彩必须与其他质粒或单链寡核苷酸(ssODN)一起转移。

对于一代 转基因动物可以用纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA微量注射受精受精卵。 体细胞的 基因修饰可以借助于编码Cas9和sgRNA的病毒载体来进行。

卡斯9系统的一大优势可以在 转基因动物。如上所述,将sgRNA和Cas9蛋白以及所需的江苏体彩直接转移到合子(受精卵)中就足够了。 卡斯9程序可一次运行修改多个等位基因。相比之下,其他技术取决于将胚胎干细胞注射入胚泡之前(后期胚胎阶段)的耗时的遗传操作。干细胞程序提供了杂合子个体,需要进行长时间的交配过程才能最终成为纯合子动物。在这种情况下,Cas9系统可以为研究人员节省大约一年的时间。

此外,Cas9系统还可以与成年动物一起使用。这个新的选择可能会增强治疗性基因的编辑,并为研究人员提供治疗各种疾病的新机会。

除了用作基因编辑工具之外,Cas9系统还具有许多其他潜在的应用程序。不仅可以利用江苏体彩的切割功能,而且还可以通过抑制核酸酶的活性将Cas9蛋白转化为高度特异性的江苏体彩探针。 卡斯9的此功能可以完成各种各样的任务。例如,Cas9蛋白可以与转录激活子融合以用于靶向基因表达。当与荧光蛋白结合时,Cas9蛋白可以标记不同的江苏体彩基因座,从而可以研究染色体动力学。此外,已经建立了化学激活和/或光激活的Cas9蛋白来获得基因表达的时间控制。

Outlook

用于基因编辑的Cas9核酸酶起源于细菌抗病毒CRISPR / 卡斯9系统。与合成的sgRNA结合使用,研究人员可以比以前更轻松,更快捷地敲除或敲除基因。这一发展为基础研究,尤其是药物开发或药物治疗创造了新的机会。此外,应用科学将有可能创造出更多有利可图的作物或微生物,以生产各种基础材料。

卡斯9系统还具有增强基因治疗方法的潜力。可以想象直接消除产生疾病的有害突变,或从T细胞中切除HIV基因序列,从而避免艾滋病的发作。

除了其对分子生物学的主要影响外,Cas9核酸酶还产生了许多显微镜应用,例如内源蛋白标记,基因位点的动态成像或光激活转录系统的发展。

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