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如何通过使用正确的物镜来校正立体显微镜的像差

消除浸入液体或嵌入样品/样本的折射率不匹配

对于浸没在液体中或嵌入聚合物中的样品/样品,由于球差会阻碍高质量的显微镜观察。空气与样品的液体或包埋介质之间的折射率不匹配是导致像差导致江苏体彩失真的原因 [1]。像差可能导致难以准确观察样品的某些特征。对于使用光学显微镜(立体或复合)观察浸没或嵌入样品的用户,可以校正折射率失配的物镜,可以得到球像差大大降低且聚焦更清晰的江苏体彩。

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Background

缺点之一 体视显微镜 分辨力提高的原因是观察和记录未直接暴露于空气中的样品/标本变得更加困难,例如未嵌入空气中的样品/标本(例如电子部件)或浸没在液体中的样品/标本(例如水生生物)。当观察浸入水溶液中的样品时,样品的精细结构和特征会显得模糊,尤其是在高放大倍数下。

这种模糊或江苏体彩失真是由于球差引起的。像差是由空气折射率(n = 1) and water (n = 1.3), called the 折射率不匹配 [1]。有趣或重要的结构很容易被遗漏或忽略,因为可能会发生球面像差。"normal objectives"适用于针对直接暴露在空气中(没有浸没或嵌入介质)的样品而优化的体视显微镜。对于使用a创建的3D复合江苏体彩"z-stacking"在软件功能上,像差特别明显,因为结构在z方向上看起来很细长。

对于复合显微镜,也会发生相同的现象,但是存在可以将液体浸入物镜与镜片和样品之间的液体层一起使用的现象。通常,浸没液体是水或油,它们有助于显着降低上述江苏体彩像差。

徕卡 计划 载脂蛋白 2x objective 于2010年推出了用于立体显微镜的显微镜。分辨率达到1,050线对/ mm(952 有效数值孔径为0.35)。与早期的显微镜系统相比,这种分辨率的提高部分是由于FusionOptics [2]. 的 FusionOptics technology utilizes asymmetric zoom lenses providing stereo microscope users the best 3D perception of an observed sample (through the eyepieces) with the highest resolution and corresponding depth of field possible. Unfortunately, when using the 计划 载脂蛋白 2x objective to image immersed or embedded media, the problem of spherical aberration can occur.

对用作斑马鱼等脊椎动物胚胎发育模型系统的水生生物的研究仍然产生了对更高分辨力,更好的透光率和更好的信噪比(S / N)性能的需求。对于具有立体显微镜的荧光应用而言,这一需求尤其如此。当使用针对暴露于空气中的样品进行了优化的高分辨率目标时,在次优条件下观察并记录了明显嵌入和浸入的样品以及带有盖玻片的样品。

消除江苏体彩像差

有显微镜物镜"correction collars"可以调整透镜浸入介质与样品浸入或嵌入介质之间的折射率不匹配。对校正环的调整会导致物镜内一组透镜的位置发生偏移。图中显示了物镜环如何校正折射率失配的图示。 1.

物镜的校正轴环使用户可以消除球差,并获得嵌入式(聚合物或玻璃)或液浸(水)样品/样本的江苏体彩,焦点更清晰,更清晰。在校正了与物镜环的折射率不匹配之后,似乎没有浸入或嵌入介质。正确调整物镜校正环既可以改善空间分辨率,又可以改善江苏体彩的信噪比。

带有校正环的立体显微镜物镜的一个例子是 徕卡 Plan Apo 2x Corr objective。与徕卡 Plan Apo 2x Corr,甚至厚的嵌入样品或浸入深水溶液中的样品(5 (mm)可以几乎没有像差成像。 

图1:浸没或嵌入的样品/样本的显微镜观察;通过光学系统追踪光线(黄色)(蓝色虚线是光轴)。
–未纠正的情况: 折射率不匹配 样品浸入/嵌入介质与空气之间的距离会导致球差和沿垂直方向的江苏体彩伸长 [1].
–校正后的情况:能够调整折射率不匹配的物镜可以在很大程度上消除像差。

Application examples

许多用户使用立体显微镜检查或记录嵌入的和液浸的样品/标本。以下示例说明了将立体显微镜与Leica结合使用时的江苏体彩质量提高 2x Plan Apo 正确的目标(假设正确的设置和调整)。

样品/样品浸入水溶液

牛肺动脉内皮细胞(BPAE)被用作研究心血管功能和疾病的模型系统 [3]。使用荧光团FluoCells的牛肺动脉内皮(BPAE)细胞江苏体彩®,MitoTracker® 红色,CMXRos,BODIPY® FL鬼笔环肽和DAPI(分子探针,荷兰莱顿)如图  2.他们是通过 徕卡 M205 FA 体视显微镜,徕卡 2x Plan Apo物镜或徕卡 2x Plan Apo Corr objective, 徕卡 DFC3000G 数码相机,以及 LAS X软件.

在图 在图2A中,仅具有鬼笔环肽通道的荧光江苏体彩和由徕卡拍摄的明场江苏体彩 2x Plan APO物镜(无校正项圈)。身体® FL鬼笔环肽选择性染色F-肌动蛋白丝。获取江苏体彩Z堆栈,并显示每个堆栈的最清晰江苏体彩。没有应用任何江苏体彩处理算法,因此这些江苏体彩显示原始数据。

在图 2B,江苏体彩是用徕卡拍摄的 2x Plan Apo 校正套环设置为0.25的Corr物镜 毫米,以补偿嵌入介质和盖玻片。通过肉眼观察和比较在稍微不同的设置下用校正环获得的Z堆栈序列来确定校正环的最佳位置。江苏体彩清楚地显示出校正环上正确设置对江苏体彩质量的影响。细胞中的肌动蛋白丝结构变得更加明显,信噪比得到改善。与大多数类型相比,BPAE细胞样品非常薄。

图2:A:BPAE细胞的荧光江苏体彩用盖玻片包埋在载玻片上并用 徕卡 M205 FA stereo microscope where a 2x 计划 载脂蛋白 objective with no correction collar was used. 的 actin filaments in the cells (red arrow) are visible, however appear blurry. 的re is also a slight blurring (white arrow) at the boundaries of the cells. B: 相同的样本 徕卡 2x Plan Apo Corr objective 使用校正领。肌动蛋白丝(红色箭头)变得更加可见。单元边界处的模糊(白色箭头)显着减少。原子核中的结构可以更好地解析。

在较厚的样本中可以看到更大的效果,例如将斑马鱼的幼虫浸入水溶液中,深度可达几毫米 [4]。下面的视频(图 3)被收购 徕卡 M165 FC 体视显微镜,徕卡 2x Plan Apo物镜或徕卡 2x Plan Apo Corr物镜和Hamamatsu Orca-R2数码相机。斑马鱼的幼虫表达绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)在其血管中。

图3:表达绿色荧光蛋白的斑马鱼幼虫的荧光视频成像(绿色荧光蛋白)浸入水溶液中。江苏体彩是用徕卡拍摄的 M165 徕卡FC立体显微镜 2x Plan 使用带(右图)和不带(左图)校正环的Apo物镜。在两个视频中都可以看到斑马鱼幼虫的心脏跳动。幼虫在右侧的未校正江苏体彩中显得模糊。由M. J. Hamm and W. Herzog, 血管生成实验室, Max 计划ck Institute for Molecular Biomedicine and Westfälische Wilhelms University in Münster, Germany.

样品嵌入聚合物中

商业上出售的发光二极管倾向于被嵌入聚合物中以用于实际用途。嵌入聚合物中的LED的江苏体彩如图1所示。 4.他们是通过 徕卡 M205 FA 体视显微镜,徕卡 2x Plan Apo物镜或徕卡 2x Plan Apo Corr物镜,DFC450数码相机和 LAS X软件.

在图 4A, a bright field image captured with the 徕卡 2x Plan APO物镜(无校正项圈)。可以看到LED的各个部分。获取江苏体彩Z堆栈,并显示每个堆栈的最清晰江苏体彩。没有应用任何江苏体彩处理算法,因此这些江苏体彩显示原始数据。

在图 如图4B所示,江苏体彩是用Leica拍摄的 2x Plan Apo 校正套环设置为2的Corr物镜 毫米以补偿塑料。与以前一样,通过视觉观察并比较在稍微不同的设置下用校正环获得的Z堆栈序列,可以确定校正环的最佳位置。可以看到江苏体彩质量明显不同。 LED段的焦点更加清晰,信噪比得到改善。

图4:A:用Leica捕获的嵌入聚合物中的LED的明场江苏体彩 M205 徕卡FA立体显微镜 2x Plan 使用无校正项圈的Apo物镜。各个LED片段可见,但模糊。 B:徕卡的样本相同 2x Plan Apo 使用带有校正环的Corr物镜。现在,LED细分更加清晰。明显减少了模糊。

Summary

由于空气与样品或样本的液体或包埋介质(例如聚合物)之间的折射率不匹配而引起的球差会降低显微镜观察的质量 [1]。在观察过程中,样品的特定特征可能会失真。光学显微镜(立体或复合)用户通过观察浸入或嵌入的样品,可以通过使用可校正折射率失配的物镜来避免像差和江苏体彩失真。

Acknowledgements

我们要感谢Mailin J. Hamm和Wiebke Herzog 血管生成实验室 at the Max 计划ck Institute (MPI) for Molecular Biomedicine and the Westfälische Wilhelms University in Münster, Germany for supplying the videos of zebrafish larva (数字 3).