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浸入目标:使用油,甘油或水克服某些分辨率极限

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为了使用显微镜以高放大倍率检查样品,需要考虑许多因素。这些包括分辨率,数值孔径(NA),物镜的工作距离以及物镜的前透镜通过其收集图像的介质的江苏体彩率。在本文中,我们将简要介绍在盖玻片和物镜前透镜之间使用浸没介质如何帮助提高NA和分辨率。此外,我们将考虑空气和由玻片和盖玻片组成的玻璃的江苏体彩率,以及当光从一种介质传播到另一种介质时,如何使用浸没介质部分减少失配。还有一些使用油浸系统的实用技巧,以及使用水浸物镜的好处,尤其是当 活细胞成像

Immersion Liquids

的主要问题之一 光学显微镜 为了克服光学分辨率的某些限制并增加系统的数值孔径。简而言之, 不适用 物镜的能力是从标本收集光的能力,而分辨率是物镜区分样品中细节的能力。

决议和不适用将在其他 文章,但我们现在将研究显微镜技术人员可用的浸没技术,该技术可使标本成像达到高放大倍率,同时又能克服某些分辨率极限。

用浸液代替正面之间的气隙 镜片目的 样品的盖玻片提高了物镜的分辨率。当光从一种介质传播到另一种介质(例如,通过玻璃到空气)时,它会江苏体彩-换句话说,它会弯曲并散射。江苏体彩到空气中,被防护玻璃罩反射或实际上被物镜前透镜的金属外壳阻挡的任何光线均不会影响成像。浸没液体的目的是减少来自样品的光的江苏体彩和反射量,并提高物镜捕获否则会偏离的光的能力(图1)。 

Refractive Index

光线穿过的介质的物理特性决定了光线的江苏体彩程度。 “江苏体彩率”是一个数值(无单位),它决定了光线在穿过材料时的江苏体彩程度。空气的江苏体彩率为1.0,而显微镜载玻片和盖玻片的江苏体彩率通常为1.5。考虑到这种差异,浸没液体的目的是(尽可能接近地)匹配装有样品的玻璃的江苏体彩率,因此增加了形成最终图像的光线的数量。随后,大多数浸油的江苏体彩率为1.51。有关常见的江苏体彩率,请参阅表1。

浸入介质

RI

空气

1.00

1.33

甘油(100%)

1.47

雪松油

1.51

徕卡浸油(标准和“ F”型)

1.51

 

 

玻璃

RI

玻璃(硼硅酸盐或“ Parex”)

1.47

玻璃(冠或钠钙)

1.51

 

 

安装介质

RI

细胞培养基

1.31至1.33

氟山胶TM值

1.4

延长®/延长®

1.46

VECTASHIELD®

1.44

VECTASHIELD® 硬套TM值

1.46

Mowiol®

1.41 – 1.49

均匀浸没系统

理想的方案是创建所谓的“均质浸入系统”。使用该系统,可以获得最大的分辨率和NA。均质浸没系统的目的是(尽可能接近地)匹配物镜前透镜,浸没介质,盖玻片/载玻片,安装介质和(原则上)透镜的江苏体彩率和NA。冷凝器(参见图2和表1)。

通常不需要将浸没液体放在聚光镜的透镜上。如果正确设置并对准显微镜以在整个样品上获得最佳对比度和照明(请参阅有关科勒照明的文章),则将优化聚光镜的位置和设置,从而有助于显微镜系统的整体NA 。

Working Distance

显微镜物镜需要考虑的另一个因素是“工作距离”。这只是样品清晰聚焦时物镜和物镜之间的实际距离(图3)。当物镜移动到更靠近载玻片时,焦平面会进一步移动到样本中。但是,这在物理上受到以下限制:物镜只能移动到与防护玻璃接触为止。有一个 工作距离与每个物镜的放大倍率成反比关系。例如,一个10倍物镜的工作距离可以为4毫米,而一个100倍油物镜的工作距离通常为130毫米。相比之下,某些水浸式/水浸式物镜的工作距离约为3毫米。工作距离是另一条信息,通常刻在物镜的镜筒上,缩写为“ WD”(不要与水浸物镜混淆-见下文)。

浸油和物镜

使用油镜时要记住的一个关键因素是使用正确匹配的浸油。仅使用物镜制造商推荐的机油。多年来,雪松木油通常用于浸泡(并且仍可商购)。尽管该油的江苏体彩率为1.516,但它有变硬的趋势,如果使用后不清除,可能会造成镜片损坏。此外,这种油会吸收蓝色波长和紫外线,并且随着年龄的增长也会变黄。

大多数现代机油是合成制造的,并经过标准化处理,以确保它们不会损坏镜片或不会随年龄而变色。需要牢记的一点是,浸油具有最佳的工作温度。大多数商业合成油设计为在23°C下工作,仅1°C的变化将导致0.0004的江苏体彩率变化。还可以使用其他油在不同温度下最佳工作,但是对于大多数目的,显微镜设备应保持在23°C的稳定状态(这对于容纳共聚焦显微镜等仪器也很重要)。

当使用油浸物镜(参见图4)进行荧光显微镜检查时,建议使用特殊的低自发荧光油。许多普通的油会在某些条件下发出荧光。大多数用于荧光显微镜检查的油是通过在油名称/代号之前或之后带有字母“ F”来识别的。

使用油浸物镜

  • 首先以低倍物镜观察样品,以找到载玻片上感兴趣的区域。
  • 达到40倍物镜并为Koehler照明设置显微镜。
  • 在40倍和100倍物镜之间摆动鼻架(容纳物镜的转塔),但不要完全接合大功率物镜。
  • 从显微镜侧面看时,小心地将一滴浸油直接放在盖玻片上。将高倍物镜摆到适当的位置(并继续从侧面看镜台),先进行粗调,然后再进行细调焦,使物镜前透镜与油接触。某些油镜的前透镜是凹形的,这意味着您还应该在物镜上滴一滴油,以防止气泡陷入凹透镜中。
  • 然后,您可以再次向下看目镜。仅使用精细对焦来调整视野。尽管大功率物镜的前端带有弹簧,但在此阶段粗略聚焦很容易导致盖玻片破裂或滑动,还可能损坏物镜前透镜。
  • 即使您打算检查其他载玻片,在此阶段也应从物镜上清除油,以防止可能污染显微镜的其他部分。浸入的油会(并且会)渗透并损坏不适合浸入的显微镜组件和物镜。使用镜头清洁棉纸清除镜头上的多余油脂。每次擦拭前,请用一块干净的纸巾擦拭物镜前透镜,直到没有油迹为止。可以使用市售的除油溶液,也可以使用少量的二甲苯最终清洁镜片。同样,重要的是检查 建议 在将任何解决方案应用于镜头之前,请先从物镜制造商处获得。 

浸水物镜

在研究级显微镜(通常是共聚焦显微镜)上发现的一种较不常见的浸没物镜是“水浸”物镜,通常 缩写的 在物镜镜筒上为“ WI”或“ W”。当对细胞培养基中的活细胞成像时,强烈建议使用水浸物镜。有两种类型的水浸物镜(见图5)-“水浸”和“浸水”(通常在物镜镜筒上缩写为“ WD”,不要与“工作距离”相混淆)。

水浸物镜通常与立式显微镜配置一起使用,并用于直接浸入水或水基介质/缓冲液中。制造浸渍镜的目的是提供非常长的工作距离。它们还用陡峭的鼻架制造,该鼻架由惰性材料(例如陶瓷)制成。水浸物镜的使用方式与油浸物镜相似,但用水代替油滴。

使用水浸物镜的优点之一就是简单地将水用作浸水介质。这显然很容易涂抹和清除。此外,根据所执行的成像,您不需要使用特定的浸油,也不需要使用显微镜和物镜制造商指定的浸入介质。但是,使用水浸物镜时有一些缺点。与水性物镜相比,油浸物镜可实现更高的分辨率。另外,由于水的粘度(与油相比),使用水浸物镜可能会受到振动和空气运动的影响。可以通过确保将显微镜放置在防震台上来克服此类伪影。另外,一种更简单的解决方案是在幻灯片上放置一个特殊的环,以形成一个小水池。水浸物镜的最终缺点是成本。某些水浸物镜的成本可能与完整的研究级显微镜相同。

徕卡提供了一种浸水式微型分配器,它克服了长期活细胞成像或筛选实验中水蒸发的潜在问题(图6)。 

总体而言,水浸物镜的主要优势在于对活细胞和组织成像时。这主要是由于油浸物镜不适用于通过用于活细胞显微镜检查的细胞或组织腔室进行成像的事实。 

Live Cell Imaging

活细胞 通常包含在室内,并被细胞培养基(或缓冲液)覆盖。腔室(和培养基)有助于确保细胞或组织在成像时保持在稳定的环境中。结果,最佳焦距将与腔室的盖相距相对较大的距离。这使得油浸物镜的短工作距离不适合通过盖玻片/腔室,培养基/缓冲液以及实际细胞/组织成像。

此外,由于油和水具有不同的江苏体彩率,因此使用油浸物镜观察水性介质中的细胞会增加其他江苏体彩问题。

当观察室内的活细胞时,光路将遇到不同的江苏体彩率。腔室/盖玻片的材料以及覆盖细胞或组织的水性介质将各自具有不同的江苏体彩率。形成样本图像的光在每个阶段都会江苏体彩,这会导致球差。 

Correction Collars

尽管可能会在水,玻璃或塑料界面上发生江苏体彩,但通常会为此校正水浸物镜。此外,某些水浸物镜还带有校正环。可以调节物镜镜筒周围的这些环,以适合不同厚度的保护玻璃。

徕卡还提供 电动校正领物镜 可以对物镜进行精确和远程的调整,以确保以最小的样品和成像设置干扰恢复最佳分辨率(图7)。

水浸和共聚焦

最后,水浸物镜最适合的应用之一是 共聚焦成像 因此,它们通常是许多共聚焦系统的标准功能之一。由于水对油的粘度低,使用这些物镜会导致盖玻片上的表面张力较小,这意味着样品移位的机会较小,尤其是在获取Z形堆栈的过程中。

甘油浸渍物镜

甘油是一种附加的浸没介质。将许多固定样品固定在Mowiol,Vectashield或基于甘油的类似混合物中(见表1)。这些介质的江苏体彩率接近80/20甘油/水混合物的江苏体彩率(RI = 1.45)。甘油物镜(参见图8)是固定在此类介质中的样品的最佳选择。

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