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活细胞成像简介

了解复杂而快速的细胞动力学是深入了解生物学过程的重要一步。因此,当今的生命科学研究越来越要求在分子水平上实时研究生理事件。

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观察和分析活细胞的挑战

在固定的细胞或组织中,获取有关样品“分子状态”的信息已经是一项艰巨的任务。如果必须实时获取信息,这将变得更加困难,因为实验过程中的细胞必须尽可能自然地运转。另外,由于许多事件仅持续数秒或什至毫秒(例如,细胞离子水平的变化),因此必须在相对短的时间内采样大量信息。

解决这些挑战性需求的一种方法是将某些光学方法统称为活细胞成像。活细胞成像允许研究活细胞中的动态生理过程,而不是提供细胞当前状态的“快照”。它将快照变成电影。活细胞成像可提供单细胞,细胞网络中动态分子事件的时空信息(原位)甚至整个生物(体内)。这些功能使活细胞成像成为解决细胞生物学,癌症研究,发育生物学和神经科学中的生理问题的必要技术。

近年来,电子,光学和生物化学领域的重大进步使科学家更容易获得活细胞成像。通过使用优化的显微镜,专用光源,高速相机,高灵敏度的检测器和专门开发的荧光标记,当今的活细胞成像方法既提供了技术成熟又创新的工具集,可满足研究单细胞或整个细胞网络挑战性的需求在分子水平上实时进行。

具有线粒体标记(MitoRed®)和荧光钙染料(Fluo-4)的细胞的活细胞成像

用共焦显微镜Leica采集的图像 TCS SP5(DMI6000 CFS)和徕卡 LAS AF7000成像软件。由亚琛工业大学亚琛工业大学生物学研究所II生物研究所Sophie Veitinger博士提供。现在的地址:马尔堡菲利普斯大学Sophie Veitinger博士,德国细胞生物学和细胞病理学研究所

相应的出版物(不是图像源):
Purinergic信号可动员小鼠支持细胞,线粒体S,线粒体T,Cainarca S,Fluegge D,Engelhardt CH,Lohmer S,Hatt H,Corazza S,Spehr J,Neuhaus EM,Spehr M;中的线粒体Ca 2+。生理学杂志。 2011年11月1日; 589(Pt 21):5033-55

活细胞成像中的一般问题

活细胞成像通常可以通过培养的细胞系(例如HEK细胞,HeLa细胞),原代细胞培养物(例如皮肤细胞,神经细胞),急性切片制剂(例如脑切片)或整个器官或生物体来进行。一个主要任务是在实验过程中使细胞保持健康状态,因为细胞会遭受光毒性并被带离其“自然”环境。

单元外解决方案

使用不同类型的人工细胞外溶液(林格氏溶液,人工脑脊髓液(ACSF)和培养基(例如Leibovitz L-15))为细胞提供必需的离子和其他辅助因子,以维持其生理功能。用于活细胞成像的范围非常简单"salty"溶液(例如林格氏溶液)到相当复杂的混合物(例如Leibovitz L-15)。

但是,所有解决方案的共同点都包括一个pH缓冲系统,因为暴露在环境中会极大地改变介质的pH(通常为7.2.-7.4)。在许多细胞外溶液中,通过添加10–20可以实现pH缓冲 mM HEPES(2- [4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸),两性离子有机化合物。不幸的是,对于许多细胞,细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲剂(例如MOPS,TES)缓冲,因为培养基中缺乏pH缓冲碳酸氢盐会损害细胞。为了克服这个问题,必须将二氧化碳输送到细胞外溶液中(当与细胞外溶液接触时,二氧化碳会转化为碳酸氢盐)。这可以通过两种方式来实现:一种是持续释放气态二氧化碳(通常以碳素的形式存在:95)。 % oxygen with 5 %二氧化碳)注入细胞外溶液中,并不断地为细胞提供超融合作用。与细胞培养相比,这种方法通常用于具有更高新陈代谢转换率的切片制备。

另一种常用的方法是将细胞保存在设计用于调节气氛以及在许多情况下调节温度的培养室中。在这种文化中,气氛为5–7 不断提供%的二氧化碳,并且可以严格控制温度。但是,要确定一种化学缓冲的细胞外溶液是否足以使细胞保持良好状态,或者是否有必要输送二氧化碳甚至使用气候室,就必须考虑所用样品的类型和持续时间。实验。在许多情况下,化学缓冲溶液足以用于细胞培养和较短的实验。处理急性切片通常需要充足的二氧化碳供应,因为新陈代谢的转化率要高得多。但是,对于许多细胞类型和长时间的实验,必须使用气候箱。

Phototoxicity

用荧光染料在活细胞成像中的另一个问题是激光或高强度弧光放电灯的入射光对细胞造成的损害,即所谓的光毒性。光毒性主要是在合成荧光染料被激发时发生的。在它们的激发态下,它们中的许多与分子氧反应并产生自由基。为避免光毒性,必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间,以使入射的高能光的剂量尽可能低。在实验设计期间,必须考虑实验的持续时间。在长期实验中,通常不需要高帧速率。因此,图像获取的周期频率通常可以例如从每秒超过10帧到每秒1帧甚至更低。这大大降低了样品上入射光的剂量,因此大大降低了光毒性。

人们可能还会考虑更改图像采集设置,因为在大多数情况下,可以通过将相机功能用作装仓或提高增益或使用特殊的弱光相机(例如, 电磁 -CCD 相机)。这样做,可以在不增加激发持续时间或光强度的情况下实现更好的信噪比和信号质量,而这两者都导致更高的光毒性。另外,选择具有长激发波长的荧光团可防止光毒性,因为与具有短激发波长的荧光团相比,传递到样品的能量低。荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白))通常无光毒性,因为它们的光敏位点位于多肽被膜覆盖的蛋白质内部。

Focus drift

此外,焦点漂移的发生,特别是在长期实验中,可能是活细胞成像实验中的一个问题。可以通过使用配备有软件或硬件控制的自动对焦的成像设置来避免这种情况。

图5:cow豆的初生叶片(Vigna unguiculata"California Blackeye")接种了含有 绿色荧光蛋白基因插入病毒RNA中的运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)之间 2. The 绿色荧光蛋白 大量表达为游离蛋白(因此不与MP或CP融合),并且可以定位在被感染的表皮和叶肉细胞的细胞质和细胞核中。由实验室生物分子科学系Joan Wellink博士提供。分子生物学和 实验室植物科学系Jan Jan Lent博士荷兰瓦赫宁根农业大学病毒学系。

视频1:用DIOC6染色的活洋葱鳞茎细胞,同时进行透射光检测;用共焦显微镜购得 TCS SP2 AOBS RS,物镜63倍,变焦1.5,平均两倍折线,格式512 x 265,每秒4.7帧。

视频2:瞬时转染COS细胞的表达 绿色荧光蛋白融合蛋白。主要的胞质蛋白在细胞内形成针头。 3D堆栈(10.14 每5记录一次 seconds with 14 每节10个 分钟。对于电影,使用了堆栈的最大投影。 512 x 512 像素,双向扫描,缩放 2, objective HCX 载脂蛋白 L U-V-I 63.0 x 0.90 W 紫外线。图片由Jocelyn Laporte,EquipeGénétiqueHumaine,IGMBC中心影像,法国伊尔基希(Ellkirch)提供。

用于活细胞成像的方法

用于活细胞成像的宽视野和共聚焦显微镜技术的范围也非常广泛。通常,使用复合显微镜和对比方法(例如相位对比和微分干涉对比)可以观察到细胞随时间的生长,细胞聚集或细胞运动(迪克)。此外,较大样本的延时成像,例如斑马鱼胚胎的发育,通常是通过体视显微镜或宏观镜进行的。在过去的几十年中,先进的荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜的应用迅速增加,已将生物学研究的视角从平面改变为三维。

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活细胞成像技术–可视化生命分子动力学