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Koehler照明:五个简单步骤的简要历史和实用设置

的技术 科勒照明 是在任何给定条件下实现最佳成像的最重要和最基本的技术之一 光学显微镜 设定。尽管通常应将其用作设置显微镜的一部分,但许多显微镜专家却认为正确的设置既复杂又费时,因而推迟了使用,因此仍然没有得到广泛应用。通过了解实际上在此技术中已调整过的显微镜的两个主要组件(隔膜和次级冷凝器),正确的设置仅需花费几分钟。正确对准的显微镜可以大大提高图像的均匀对比度和照明度,以及更高的 解析度 和更多细节。除了如何通过五个简单的步骤调整组件之外,本文还将介绍该技术的历史。

Koehler照明技术以其发明者August Koehler(1866-1948)的名字命名,该发明者于1893年发表了该方法。在出版之时,大多数显微镜都依靠镜子和煤气灯作为照明源。再加上对于光学显微镜,研究人员正在使用需要长时间曝光的乳胶板,这通常会导致不一致。

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A Brief History

在1893年发表的论文中,"Ein neues Beleuchtungsverfahrenfürmikrophotographische Zwecke"该技术发表在《科学显微镜与显微技术杂志》上的“用于显微照相的新型照明系统”中,出版了当时显微学家面临的主要问题。 Auer气体灯和氧化锆灯是该时代可用的主要照明光源,但它们倾向于产生不必要的“眩光”。

Auer气体灯以奥地利科学家兼发明家Baron Carl Auer von Welsbach(1858-1929)的名字命名。他因在整个欧洲用作街道照明的燃气罩获得了专利而闻名。尽管Auer气体灯仍会产生碳酸和一定量的热量,但《伦敦天然气照明和卫生供水杂志》称Auer灯“非常适合”显微镜检查。 

替代的氧化锆光是通过加热元素锆产生的强化学光源。但是,使用这种光源,科勒宣称“很难或不可能实现均匀的照明”。 Koehler意识到,为了保持照明的一致性,需要考虑显微镜的每个组件,并将它们彼此正确对齐。通过调整隔膜和聚光镜,他克服了过热和光线一致性的主要问题(甚至使用了操作镜来代替凸透镜!)。

重要原则

即使在今天,他始终如一的照明技术仍被广泛使用,并构成了许多技术的基础,包括 共聚焦 , 相衬 微分干涉对比 ( 迪克 )。一旦您知道如何为正确的Koehler照明设置显微镜,它就会成为第二自然,并将改变您的成像工作。它只是光学显微镜最重要的原理之一。

设置显微镜以进行科勒照明只需不到一分钟的时间。这样可以确保光源均匀照射样品,产生更清晰的图像,并增加染色区域之间或切片中组织区域之间的对比度。您还将能够从每个样本中收集更多的成像数据。

如果您需要在Powerpoint演示文稿,海报演示文稿中使用图像或提交给日记本的图像,则必须使用Koehler照明。这种简单的五步技术可以走很长一段路,并且只需少量实践,就可以在捕获图像之前轻松地成为第二自然。

除显微镜物镜外,Koehler照明还应注意其他两个组件(并已对其进行了调整)。

The Field Diaphragm

“视场光阑”通常位于仪器的底部(在立式显微镜中),作为显微镜主体的一部分(图1)。一些较旧(或更简单)的显微镜可能只是为光源设置了“开/关”开关,并且可能没有视场光阑来控制来自光源的光强度。视场光阑只是控制最终到达载物台上的幻灯片的光量。通过控制来自光源的光量,您可以减少来自光源的眩光,从而获得具有更高对比度的图像。视场光阑通常由镜头周围的滚花环控制。

次阶段冷凝器

台下聚光镜(图1)位于立式显微镜的平台正下方(或在平台上方,但在倒置显微镜中位于光源/视场光阑之前)。尽管它的聚焦轮类似于显微镜的精细/粗聚焦,但是该组件用于聚焦来自光源/视场光阑的光,而不是将样品聚焦。 

“次级聚光器”收集来自光源的大部分光,并将其作为成像光锥聚集在显微镜载物台上的载玻片上。正确调节该聚光镜后,照亮样品并进入物镜的光将得到充分优化。这在最终图像中产生均匀的强度和对比度。由于显微镜的每个物镜都是不同的,这意味着在更改放大倍数时需要调节次级聚光镜。

在子级聚光器内,有两个组成部分,可在设置正确的Koehler照明时进行调整。这些是定心螺丝和膜片。与场光阑一样,子级聚光镜也有一个调光光阑,类似于场光阑,它可以通过围绕聚光镜的滑动控制或滚花环来调节。该光圈控制照射样品的光锥的角度。正如我在文章中提到的 数值孔径 (NA),整个显微镜系统的NA不仅取决于物镜。实际上,当打开二级冷凝器膜片时,这会增加整个仪器的NA,从而带来更高的分辨率,对比度和最佳照明效果。定心螺钉可确保用于照亮幻灯片的光直接位于视场的中心,从而在整个样本上提供均匀的强度。

柯勒照明的五个步骤

Step 1:

开始成像之前,请务必检查镜头,目镜和物镜是否干净。显微镜镜头的清洁被另一个覆盖 文章 ,但是您应该始终使用镜头清洁纸和推荐的溶剂。将幻灯片放在舞台上,然后将灯泡打开到最低位置。 

Step 2:

聚焦样品,但请记住,如果您在共享设施中使用仪器,则显微镜设置可能会完全错位。
首先,关闭视场光阑,该光阑在立式显微镜中位于仪器基座上,在倒置显微镜中位于聚光镜上方。现在,当您俯视目镜时,您会在幻灯片上看到一小圈光(图2)。

Step 3:

现在聚焦聚光镜。当您坐在显微镜旁时,聚光镜的调节轮通常位于聚焦轮的前面。向上和向下移动聚光镜,同时俯视目镜。您会看到,光圈的边缘将进出焦点(并且从红色条纹变为蓝色条纹)。使光圈的边缘尽可能锐利(图3)。

Step 4:

一旦有了清晰的光圈,就将目光从目镜移开,然后看一下显微镜的聚光镜组件。您会看到对中螺钉。您可以在隔膜关闭或几乎完全打开的情况下使冷凝器居中。我通常将聚光镜与视场光阑对准中心,在上面的第二步中将其留在其中,几乎完全关闭。拧紧螺丝的同时,再次向下看目镜。慢慢旋转螺丝时,您会看到光圈将在视场中移动。您应该力求使圆位于样品视图的中间(图4)。

将聚光镜居中后,打开视场光阑,直到光圈的边缘从视野中消失为止(图5)。 

Step 5:

(5)  最后的调节是使用光圈(或光圈)光圈。在对中螺丝下方(或在倒置显微镜上方),您会发现另一个类似于主视野光阑的光阑。在俯视目镜的同时,将其完全打开,然后开始关闭直到“光斑”消失为止。通过关闭光圈,可以增加样品的对比度,但分辨率会降低。您应该根据自己的眼睛和所观察的标本找到一个平衡点。

就这样-五个简单的步骤。

总而言之-关闭膜片,聚焦边缘,将斑点居中,打开膜片并减少耀斑。