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Label-free FLIM

生理条件下的显微镜故障

许多生物样本表现出自发荧光。它通常宽的光谱可以干扰荧光标记策略。本申请信显示了自发荧光如何作为荧光寿命显微镜显微镜中的内在对比度(fl)导致多色图像堆栈。还概述了如何将光谱成像与荧光寿命信息组合,以区分和潜在地识别生物样品中的不同荧光物质。

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显微镜会遇到自发荧光

在荧光显微镜检查中,通常自发荧光被视为许多生物样品固有的有害副作用。它倾向于与内源性荧光标记重叠有时掩盖其强度。它可能导致光谱通道分离的困难以及定量大率分析的强度。自发荧光的通常非常广泛的发射光谱可以通过传统的光谱图像记录来使其难以解决。

然而,自发荧光也有其优点。它是一种自由的荧光标记的内在形式,是完全无侵入性的。本申请字母的目的是通过荧光寿命显微镜显微镜识别几个自发荧光组件(fl)并展示他们在生物医学研究中的效用。

注意:对于基本处理 fl Techniquw请参阅申请信 Flim - 定量 in-vivo. Biochemistry

自发荧光符合科学

大多数生物样品含有生物化学物质,可以产生自发荧光。例如,细胞的氧化还原电位反映在其NAD(P)H和黄曲片中的浓度。前者更兴奋 IR. 来源,后者可以使用405 NM也是如此。相当多的结构蛋白也可以提供寿命对比,例如胶原蛋白,弹性蛋白和纤维蛋白。

植物细胞特别富含多种自发荧光分子。很常见是叶绿素,类胡萝卜素,多酚到名称,但几个。通常,这些化合物不仅可以提供无标记的对比度,还可以提供有关细胞或组织中的代谢状态或致病性改变的信息。因此,可以通过组合汲取功能的结论 fl 和自发荧光。

Label-free contrast

举例说明自发荧光的实用性作为生物样品中的对比策略,我们将分别检查动物和植物王国的一个例子。

让我们从一个规模昆虫开始。收集该植物寄生虫的不同发育阶段并立即安装。在激发波长470处存在的自发荧光的概述图像 使用10x目标记录NM(图1)。强度图像是从a创建的 fl 数据集并产生标本结构的良好表示。此处的强度编码每个像素的计数光子,而不是标准强度图像的常规单位。然而,它无法区分任何自发荧光物种(图1a)。该信息包含在寿命图(图1B)中,其使空间分辨的寿命分布呈现。它给出了不同荧光寿命部件的良好印象。

在自发荧光方面,这通常代表不同的分子种类或其组合。我们可以在天线和腿部(绿色至蓝色)围绕一定少量的小脑骨骼区分。几丁质显示出非常短的一生。周围的组织看起来相对均匀接近3 ns(黄色)。一些具有较长寿命(橙色)的散射区域可以代表其他物种,而是这里,它们更可能代表在确定寿命时简单地具有较低精度的较暗区域。

通常被认为和传达的内容 fl 图像实际上是强度调制的寿命图(图1c)。寿命信息乘以强度图像。该再现倾向于使光子统计差的较差区域进行脱模,并且它保留了强度图像中包含的更多结构信息。后者通常促进寿命的解释,就像寿命图中的橙色区域一样。我们可以得出结论 fl 允许我们在不受干扰的样品中识别不同的分子种类,并研究它们的空间相互关系。

图1:尺度昆虫的自发荧光图像(腹侧视图)。强度图像(a),寿命图(b,背景裁剪)和强度调制寿命图像(c)。寿命图显示了至少三种不同颜色的寿命的空间分辨率。长度为1.5 mm,截面的厚度代表1.3 μm. Scan format 280 x 512,物镜10x na 0.4,激励470 NM,478的排放检测 nm to 703 纳米(Sample由Kees Jalink,NCI,阿姆斯特丹,荷兰提供)。

深度 - 3D Flim堆栈

仔细看看自发荧光图像(图1),我们认识到该天线,例如,内部具有蓝色区域和内部的绿色区域。因此,绿色区域是否代表了一种不同的物种,或者是丁蛋白荧光(蓝色编码)和周围组织(以黄色编码)的(光学)混合物的相当(光学)混合物?为了解决这个问题,我们可以在较小的区域上使用更高的NA目标。我们还必须考虑到图像的Z扩展。为了更好地可视化结构的内部,我们可以记录一个 fl z堆叠(图2)。事实证明,较小的寿命是由几丁质引起的,因为天线的内部具有与中间部分透露的周围组织相同的寿命(图2a,白色盒子)。现在可以使用Z堆叠的最大投影(图2b)在扩展焦点中查看厚结构(图2b)。通过异构表面渲染促进了对3D拓扑的甚至更大的升高(图3)。注意,关节是没有依托的,这在 fl 数据。重要的分类分类功能变得可见,例如散发在所有身体段的发型砂岩。它们显然还含有几个丁蛋白物种。

图2: fl z堆栈的鳞片昆虫天线。 40 z-slices of about 1 使用40x NA 1.25透镜(A)记录μm深度。器官的最大投影显示天线和一些小毛发(B)。使用外部软件完成最大投影。视野是388 x 151 μm.

多色自发荧光

植物中的荧光成像通常通过诸如叶绿素和几种细胞壁成分以及多种内源颜料的多种荧光物质以及多种内源性颜料来稍微受阻。在这里,我们利用这些内在的自发氟化荧光来归因于否则可区分的结构差异。我们记录了从百合花的花粉晶粒(微孔)的Z堆叠(图4)。花粉颗粒的花盆具有通过眼睛和透射光(未示出)可见的黄色颜色。植物王国中这种黄色荧光料的可能候选者是例如carotinoids。我们获得了0.5 ns至1.2 ns的寿命。两个主要结构特征是通过寿命明显形成鲜明对比。在绿色中,我们识别(推定的)管电池的网状外层,其围绕着蓝色(0.5ns)呈现的核心。 Z-切片揭示了芯不填充短寿命物种,但它相当在管电池周围形成薄的内层(图4a)。扩展焦点(图4B)和3D可视化(图4C)有助于阐明两个层的相对拓扑彼此。

图4:来自LIIM SP的微孔(花粉粒)。 (百合花)。自发荧光激发与470 NM在管电池的外层中揭示了两个结构上不同的荧光物质。 45. 用20x na拍摄的z切片 0.7镜头检测482的排放 nm to 744 NM(A),使用外部软件(B)和3D IsoSurface渲染使用外部软件(C)的最大投影。孢子的纵向延伸是130 μm.