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终身–适当的选择

SP8 FALCON –即时荧光寿命图像(FLIM)

“方法太复杂了!”-关于荧光寿命测量的经常听到的抱怨。但是,这一定会改变!数据评估的新技术和新概念的发展意味着荧光寿命成像(电影)的速度将提高10倍,并且可以像标准共焦成像一样轻松自如。

该图显示了小鼠胚胎的一生图像。记录在722块缝合的瓷砖中,并分别安装了四个不同的特征时间。录制时间约为1小时–相比之下,传统录制时间约为1天。

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荧光成像超出您的想象!

荧光过程提供了两个要测量的成像参数:强度和荧光寿命。荧光寿命指定时间,分子停留在激发态。荧光染料的典型寿命可以通过观察足够大的激发-发射事件集合来测量。我们可以测量图像中所有像素的典型寿命,并将这些数字写入数组元素。那就是荧光寿命成像[1] (电影,也称为τ映射)。典型的荧光寿命为0.2到20纳秒。

荧光寿命与荧光染料的浓度无关。样品结构是用荧光染料稀疏装饰还是负载较重:寿命信号始终相同,并指示在相同环境中存在相同的荧光染料。因此,荧光寿命不受漂白的影响。当在样品深处记录时,图像将比表面图像要暗得多-寿命没有改变,但完全没有改变。这是使用寿命测量的主要好处。

如果分子环境导致激发态衰减而没有发射光子,则荧光强度会降低(猝灭)。淬灭是发射的独立途径,因此在动力学上与荧光过程竞争。现在,激发态的库可以通过多个过程衰减,因此荧光寿命缩短。寿命的这种改变可用于收集有关分子环境的信息。

淬灭的一种特殊类型是将激发能通过无辐射方式转移到相邻的不同荧光染料上:“福斯特共振能量转移”[2], 烦恼。在这里,不仅第一种荧光染料(供体)变暗且寿命缩短,而且第二种荧光染料(受主)也因“错误”的激发色而开始发光。由于这种效应需要两种荧光染料(小于10 nm)的紧密接触,因此被用作研究分子相互作用的“分子尺”。它也是许多现代的基础 烦恼-生物传感器,专门用于测量活体样品中的各种细胞内参数:Ca2 +或其他离子浓度跟踪,pH,极性和电势测量,蛋白质-蛋白质相互作用等。

FLIM - The Standard

黄金标准 电影 是“时间相关单光子计数”[3] TCSPC与共焦和多光子显微镜兼容。样品以光脉冲闪烁,并测量直到发射光子到达的时间。为了重建典型的使用寿命,在相同的样品位置重复进行几次这样的测量。要达到10%的准确度,需要测量几百个事件。然后将数据按直方图进行时间分类。然后,可以对该直方图中的事件随时间的衰减进行数学拟合,并直接提供所需的荧光寿命(图01a-c)。 

此过程是最精确和可重复的,但是需要时间。测量完成后,系统可以为下一个停滞时间约100纳秒的镜头做好准备。为了记录400个事件,测量一个像素的时间总计为40微秒。 512x512的图像将花费大约12秒的时间-与快速变化和移动的生活系统不兼容。 

当前的解决方案需要一定的技术灵活性,复杂的手动数据处理和复杂的评估程序。 

The new Standard

徕卡显微系统公司提出了一个新的 电影 解决所有这些问题的显微镜:SP8 FALCON(用于FAst Lifetime CONtrast)。

该系统基于混合探测器(HyD)[4],是终身成像的理想传感器 并且具有非常短的停滞时间。激光脉冲序列和发射光子脉冲都立即以高采样率进行数字化,并将测得的距离直接馈入数据池。这些到达时间用于输出“电影“ 图像。

新方法允许使用大多数激光脉冲,并应用一个过滤器,该过滤器仅限于发射一个光子的脉冲事件。可以通过智能数学方法纠正在第一个光子之后不久到达的不可避免的光子抽象。 所有这些因素总计使图像记录速度提高了10倍。  

全部猎鹰 电影 成像集成在共焦显微镜中。记录 电影 就像激活其他频道一样。 3D,时间和光谱系列的多维采集模式可立即用于 电影 成像。标题图像就是一个例子:具有经典组织学染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR软件,创建了具有722个图块(每个512x512像素)的图块艺术品。原始图像有190兆像素。生命周期装有四个指数,生命周期用颜色编码。

Application Examples

在功能成像领域,我们希望监视小分子,离子或电势的动态变化。这通常是用荧光探针完成的。它们中的许多都显示强度和寿命变化。也可以用荧光蛋白修饰蛋白并在活细胞中表达这些构建体。该技术允许通过利用生物分子来追踪活细胞中的分子相互作用。 烦恼 现象。最现代的工具是与所需分析物(例如Ca2 +)结合的蛋白质或肽,并用一对执行以下操作的荧光蛋白修饰 烦恼。结合分析物后,肽将发生构象变化,并且 烦恼 会发生或消失。这些探针称为 烦恼-生物传感器。生物传感器的一个例子是Epac[5],是cAMP的传感器。

SP8 FALCON中的新技术 足够快,可以使用化学传感器对荧光寿命进行成像,并且 烦恼-活细胞中的生物传感器。

无污染的应用是分析活物质中的内源性荧光。例如:癌细胞避免细胞呼吸,而更喜欢厌氧糖酵解(Warburg效应),这导致较高浓度的荧光NADH积累[6]。多光子显微镜可以 甚至无需活检也可在皮肤组织中进行深层成像。同样,寿命对比更加可靠,因为深层显微镜会受到吸收和阴影效应的影响,从而使强度信号失真。

传统上,不同的荧光染料以其不同的颜色来区分。如果激发和发射相同,则仍可以通过寿命来区分它们。发射强度和寿命可以独立记录为颜色的函数。因此,可区分的荧光染料的数量是发射谱带与拟合寿命的乘积。

图03:的原理证明 lt-染料分离(6个信号)。青海云杉叶子的新鲜部分,用480nm激发,并记录在两个通道(顶部和底部行)中,每个通道显示三个可分离的寿命(从左到右)。 Leica Microsystems的I. Steinmetz提供的支持。

All in all

徕卡微系统的SP8 FALCON(FAst寿命对比)共聚焦和多光子显微镜将所有这些新技术和概念整合在一起, 电影 适用于多个应用领域的解决方案。图像采集的速度是传统TCSPC的10倍,TCSPC是迄今为止生命周期成像的黄金标准。这提供了使用寿命对比来监测活体样品动力学和动力学的可能性。

简单的实施和自动化使研究人员无需进行费时的硬件调整和数据评估。复杂的数据采集模式(例如3D堆叠,时间间隔序列,镶嵌扫描以及激发或发射波长扫描)与 电影