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讲解

活细胞成像技术

可视化生命的分子动力学

了解复杂和/或快速的细胞动力学是探索生物学过程的重要步骤。因此,当今的生命科学研究越来越关注动态过程,例如细胞迁移,细胞,器官或整个动物的形态变化以及活体标本中的生理事件(例如,细胞内离子组成的变化)的实时变化。解决这些挑战性要求的一种方法是采用某些光学方法,这些方法统称为活细胞成像。活细胞成像可以研究活细胞的动态过程,而不必给出细胞当前状态的“快照”,而是将快照转变为电影。活细胞成像可提供单个细胞,蜂窝网络中动态事件的时空信息(原位)甚至整个生物(体内)。这些功能使活细胞成像成为解决细胞生物学,癌症研究,发育生物学和神经科学问题的必要技术。

近年来,电子学,光学和分子生物学方面的重大进步使活细胞成像易于科学家使用。

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用于活细胞成像的方法

应用于活细胞成像的显微技术范围也非常广泛。通常,使用复合显微镜和诸如相衬对比和微分干涉对比之类的对比方法,可以观察到随着时间的推移细胞的生长,细胞聚集或细胞运动。迪克)。此外,较大样本的延时成像,例如斑马鱼胚胎的发育,通常是通过体视显微镜或宏观镜进行的。在过去的几十年中,先进的荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜的应用迅速增加,已将生物学研究的视角从平面变为三维。以下是常用技术的简短概述。

离子成像–观察离子浓度的变化

通常执行的方法是使用荧光染料或蛋白质进行离子成像(钙,氯,镁),该蛋白质特别设计用于在钙结合后改变其发射行为。这使研究人员可以观察细胞离子浓度的动态变化。由于细胞质中的离子成分决定了细胞的许多关键功能,例如神经元的兴奋性,基因转录和细胞运动(仅举几例),因此细胞内离子在空间和时间方面的调控是生命科学的主要兴趣研究。同样,使用特殊的荧光染料可以对细胞内pH值或电压进行成像。用于成像离子水平,pH值或电压变化的特殊技术是比率成像方法。这些允许精确确定例如细胞内钙浓度,而不是像非比例法那样监测相对变化。

FRET –定量蛋白质间相互作用

检测动态蛋白质相互作用 烦恼 (福斯特共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)事件可以在活细胞实验中成像。 烦恼 是定量分子动力学的有用工具,例如蛋白质-蛋白质相互作用,蛋白质-DNA相互作用和蛋白质构象变化。 烦恼 成像通常使用的导数 绿色荧光蛋白 (绿色荧光蛋白),特别是CFP和YFP(分别是蓝绿色和黄色荧光蛋白),它们分别使用分子生物学方法连接到目标蛋白上。然后,CFP分子被荧光激发。只要感兴趣的蛋白质在空间上接近(<20 nm),CFP将充当供体,并将以光形式发射的能量传递给YFP,后者又充当受体。研究人员将观察到从CFP发出的蓝色荧光到YFP发出的黄色荧光的转变。就BRET而言,供体是一种生物发光分子(例如萤光素酶衍生物),可作为供体,例如 烦恼, 绿色荧光蛋白 衍生物充当受体。

图1:拟南芥共聚焦活细胞图像;内质网: 绿色荧光蛋白 绿色标记为自发荧光的叶绿体,红色标记为蓝色。基于这样的图像,例如 烦恼 要么 FRAP 分析可以完成。

FRAP –监测蛋白质和小泡运输

通常用于监测蛋白质或小泡运输的方法是光漂白后的荧光恢复(FRAP)。这里是荧光蛋白(通常 绿色荧光蛋白)连接到感兴趣的蛋白质(即要监测其运动的蛋白质)上。通常,整个细胞最初是发荧光的,因为蛋白质可能在整个细胞中丰富。然后,细胞的某个区域(通常是神经突细胞中的轴突或树突)会暴露于高强度的光(通常是激光)中,并且该特定区域的荧光被破坏(漂白)。随着目标蛋白质的移动,来自细胞其他部分的蛋白质将以一定速度重新进入漂白区,并且漂白区中的荧光得以恢复。这可以使研究人员深入了解细胞内的运输动力学。

TIRF –观察靠近细胞膜的过程

观察位于细胞质膜中或附近的事件的特殊技术是 蒂尔夫 (全内反射)显微镜。通过使用渐逝场进行荧光染料激发,仅穿透细胞60-250 nm, 蒂尔夫 显微镜提供了无与伦比的z分辨率,可对发生在质膜内或质膜附近(例如分子转运到质膜)的事件进行成像,而不会被细胞内分子发出的荧光所掩盖。

TIRF图像:Galectin-3囊泡沿肌动蛋白丝向膜附近的转运。

光活化–监测基因表达和蛋白质转运

最近开发的一种称为光激活的方法可以选择性标记细胞或整个生物体内的某些特定区域或目标区域。为了进行光活化,使用了特别设计的染料或荧光蛋白,例如可光活化的绿色荧光蛋白(paGFP)或Kaede。这些荧光团在其正常状态下不发荧光。然而,在用某些波长的光照射之后,这些荧光团可以像常规荧光团一样被激活以发出荧光。在许多情况下,这些蛋白质与某些目标蛋白质发生基因融合,然后可以监测其表达或转运。像 FRAP 然后可以使用粒子追踪技术进一步研究目标蛋白质。

MPE –深入调查流程

现代生物学研究需要真正的体内研究来补充细胞培养实验中的“准体内”。但是,很难研究像老鼠这样的生物体内发生的过程。多光子激发(MPE显微镜可以实现更深的组织渗透,因为与用于单光子激发的短波长光相比,具有较长波长的近红外激发光的散射少。的非线性性质 MPE 技术将光漂白和光毒性限制在焦点区域。这对于长期研究非常有益,因为荧光蛋白和生物体都遭受这些问题的困扰。据报道,使用适当的准备和显微镜设置,可以对组织内的几毫米进行成像。激发的精确定位使其也适用于光子操纵。 该方法已在神经生物学中得到广泛应用。

STED –研究纳米尺度的细胞动力学

受激发射损耗(STED)显微镜使科学家能够研究超出光学分辨率极限的结构。该技术利用被激发发射荧光染料的特性来消除可检测的信号。已经成功地成像了低至50-70 nm的细胞内结构。提高分辨率对于研究小细胞内结构非常重要。特别是对于那些希望研究共定位事件的人,分辨率的提高可能会产生更现实的结果。随机随机性 STED 与其他超分辨率技术相比,可实现非常快速的成像。影片速率 STED-获取已经实现,这允许实时研究细胞动力学。

图3: STED 带有活页标签技术的活细胞成像:Vero细胞,结构:EB3, 瞬时转染;标签:俄勒冈绿色488。

FLIM –活细胞中的空间测量

荧光寿命成像的优势在于数据不依赖于信号强度。因此,它不受诸如光漂白和浓度变化等常见伪影的影响。使用时间相关的单光子计数, 电影 从单分子检测数据重建图像。可以记录和分析亚纳秒级的荧光寿命的最小变化。该方法可用于研究各种导致荧光寿命改变的细胞外和细胞内环境修饰。 电影-基于 烦恼 分析对发射强度不敏感,从而提高了定量数据的精度。

CARS和SRS –使用振动对比的无标签方法

活细胞中几乎所有的荧光成像方法都基于荧光蛋白的遗传表达。这涉及大量的技术努力和大量的费用。此外,外部基因的表达可能会改变微环境,从而导致生理现实数据的变化。相干反斯托克斯拉曼散射(汽车显微镜和受激拉曼散射(SRS)显微镜是非线性共焦方法,不依赖于荧光染料。这些无标签方法可对样品中特定化学键的振动状态进行成像。可以以高分辨率和极佳的信噪比成像对活生物体中特定化学键(例如轴突周围髓磷脂中的脂质)的积累进行成像,而无需染色。

未来是量化的

生物学研究已经脱离了描述性研究的时代,进入了定量分析的时代。新的活细胞成像技术在空间和时间上都朝着更高分辨率的方向发展。现在,技术发展集中于对纳米范围内的单个分子和短至几皮秒的分子反应的定量研究。