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显微镜分辨率:概念,因素和计算

艾里光盘,阿贝的衍射极限和瑞利准则

在显微镜下,“分辨率”一词用于描述显微镜区分细节的能力。换句话说,这是样本的两个不同点(无论是观察者还是显微镜相机)仍可以作为独立实体看到的最小距离。

显微镜的分辨率本质上与光学组件的数值孔径(NA)以及用于检查样本的光的波长有关。另外,我们必须考虑衍射极限,这是恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)在1873年首次描述的。

本文介绍了这些概念背后的一些历史,并使用相对简单的术语解释了每个概念。

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分辨率和数值孔径

数值孔径(NA)与光通过的介质的折射率(n)以及给定物镜(NA = n x sinα)的角孔径(α)有关。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的数值孔径,还取决于整个系统的数值孔径,同时还要考虑到显微镜聚光镜的数值孔径。更多图片细节将在 显微镜系统 其中所有的光学组件都正确对齐,具有相对较高的NA值,并且彼此协调工作。分辨率还与用于对标本成像的光的波长有关。短波长的光比长波长的光能够分辨更多的细节。

处理分辨率时,需要考虑三个数学概念:“阿贝衍射极限”,“艾里圆盘”和“瑞利准则”。这些内容按时间顺序在下面介绍。

乔治·比德尔(A.

乔治·比德尔·艾里(George Biddell Airy,1801-1892年)是一位英国数学家和天文学家。到1826年(25岁),他被任命为三一学院的数学教授,两年后,他被任命为新的剑桥天文台的天文学教授。从1835年到1881年,他是“皇家天文学家”,并以他的名字命名了月球和火星陨石坑。

同样在1835年,他在《剑桥哲学学会学报》上发表了题为《论具有圆孔的物镜的衍射》。艾里非常从天文学家的角度撰写了这篇论文,他在论文中描述了“好望远镜所看到的围绕恒星图像的环或射线的形式和亮度”。尽管在不同的科学领域进行了写作,但这些观察结果与其他光学系统以及显微镜有关。

一个 通风盘 是光的最佳聚焦点,可以由受衍射限制的完美对准系统中的圆形孔径确定。从上方看(图1),它看起来像是一个亮点,周围是同心环或波纹(更正确地称为 通风图案)。

衍射图案由光的波长和光通过的孔径的大小确定。艾里斑的中心点包含大约84%的发光强度,其余16%围绕该点分布在衍射图中。当然,用显微镜观察时,标本中有很多光点,更合适的是考虑多种“艾里图案”,而不是“艾里盘”一词所描述的单个光点。

如图1下半部分所示的Airy模式的三维表示也称为“点扩展函数”。

恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)和“阿贝(Abbe)衍射极限”(1873)

恩斯特·卡尔·阿贝(Ernst Karl Abbe,1840-1905年)是德国数学家和物理学家,在1866年,他遇到了卡尔·蔡司(Carl Zeiss),他们一起创立了被称为“蔡司光学厂”(Zeiss Optical Works)的蔡司。此外,他还于1884年与他人共同创立了Schott Glassworks。阿贝也是第一个定义该术语的人 数值孔径。 1873年,阿贝发表了他的理论和公式,解释了显微镜的衍射极限。阿贝认识到标本图像由多个重叠的,多强度的衍射极限点(或艾里斑)组成。

为了增加 解析度 (d =λ/ 2 不适用),必须使用更短的一个 波长 (λ) 光或通过相对较高的成像介质 折光率 或带有高光学元件 不适用 (或者实际上是所有这些因素的组合)。

但是,即使考虑到所有这些因素,由于整个系统的复杂性,波长在400 nm以下的玻璃的透射特性以及在整个显微镜中获得高NA的影响,实际显微镜系统的限制仍然受到一定限制。显微镜。在理想的光学显微镜中,横向分辨率限制在200 nm附近,而轴向分辨率大约在500 nm(有关分辨率限制的示例,请参见下文)。

约翰·威廉·斯特鲁特(John William Strutt)和“瑞利准则”(The 瑞利准则)(1896)

约翰·威廉·斯特鲁特(John William Strutt),第三任雷利男爵(1842-1919)是一位英国物理学家,也是一位多产的作家。在他的一生中,他撰写了466篇惊人的出版物,其中包括430篇科学论文。他撰写了广泛的主题,包括鸟类飞行,心理研究,声学等。1895年,他发现了氩气(后来,他又为此获得了1904年诺贝尔物理学奖)。

Rayleigh建立并扩展了George Airy的工作,并于1896年发明了“ 瑞利准则”理论。RayleighCriterion(图2)定义了衍射极限系统的分辨率极限,换句话说,当两个点光线是可区分的或彼此分辨的。

根据艾里叶圆盘的理论,如果两个单独的艾里叶圆盘的衍射图谱不重叠,则它们很容易区分,“分辨良好”,并且符合 瑞利准则 (图2,左)。当一个Airy圆盘的中心与另一个圆盘的衍射图的第一个最小值直接重叠时,它们可以被认为是“刚刚分辨的”,并且仍然可以区分为两个单独的光点(图2中部)。如果艾里斑比这更近,则说明它们不符合瑞利准则,不会“分辨”为两个不同的光点(或样本图像中的单独细节;右图2)。

如何计算显微镜的分辨率

考虑到所有上述理论,很明显在计算分辨率的理论极限时需要考虑许多因素。分辨率也取决于样品的性质。让我们看一下使用阿贝衍射极限以及瑞利准则来计算分辨率。

首先,应记住:

不适用 = n x正弦α

其中,n是成像介质的折射率,α是物镜角孔的一半。物镜的最大角孔径约为144º。该角度的一半的正弦值为0.95。如果将浸没物镜与折射率为1.52的油一起使用,则物镜的最大NA将为1.45。如果使用“干燥”(非浸入式)物镜,则该物镜的最大NA将为0.95(因为空气的折射率为1.0)。

阿贝的横向(即XY)分辨率的衍射公式为:

d =λ/ 2 不适用

其中,λ是用于对样本成像的光的波长。如果使用514 nm的绿光和NA为1.45的油浸物镜,则分辨率的(理论上)极限为177 nm。

阿贝的轴向(即Z)分辨率的衍射公式为:

d = 2λ/ 不适用2

同样,如果我们假设以514 nm的波长观察标本的NA值为1.45,则轴向分辨率将为488 nm。

瑞利准则是基于阿贝衍射极限的略微改进的公式:

R = 1.22λ/ 不适用obj + 不适用cond

其中,λ是用于对样本成像的光的波长。 不适用obj是目标的NA。 不适用cond是电容器的NA。 “ 1.22”是一个常数。这是从Rayleigh关于贝塞尔函数的工作得出的。这些用于计算系统中的问题,例如波传播。

考虑到冷凝器的NA,空气(折射率为1.0)通常是冷凝器和载玻片之间的成像介质。假设聚光镜的角孔为144º,则NAcond值将等于0.95。

如果使用514 nm的绿光,NA为1.45的油浸物镜,NA为0.95的聚光镜,则分辨率的(理论上)将为261 nm。

如上所述,用于对样本成像的光的波长越短,则可以解决的细节越多。因此,如果使用可见光的最短波长为400 nm,并且油浸物镜的NA为1.45,聚光器的NA为0.95,则R等于203 nm。

为了在显微镜系统中获得最大(理论)分辨率,每个光学组件应具有可用的最高NA(考虑到角孔径)。此外,使用较短波长的光查看标本将提高分辨率。最后,整个显微镜系统应正确对准。