Fluorescence
荧光是一种分子现象，其中物质在很短的时间内吸收光（激发）并发出较长波长的光（发射）。当荧光染料吸收光时，会吸收光子形式的能量，从而将电子激发到更高的能量状态。光子的吸收过程非常迅速，随后立即返回到较低的能量状态，然后伴随着光子的发射，如果在可见范围内发射光，则可以观察到。
这种短暂的持续时间（纳秒）将其与其他形式的发光（例如磷光）区分开来。激发峰和发射峰之间的波长差称为斯托克斯位移。斯托克斯位移大的荧光染料很容易激发并在荧光显微镜下观察其发射。在透射光照明下，小的斯托克斯位移可能使得无法在其激发峰处照亮荧光染料，而无法在其发射峰处观察荧光色。
共聚焦激光扫描荧光显微镜可以用波长比发射光更长的光子进行双光子激发。然后，电子以两个所需能量的一半的光子进入激发态，同时到达。在大多数情况下，电子在下降到基态之前，会以与正常单光子激发相同的激发态结束。同样，发出的荧光与正常单光子激发发出的荧光相似。
Fluorochromes
许多非有机和有机分子均显示荧光发射，尤其是在使用高能辐射激发的情况下。当植物或动物组织兴奋时 紫外线 -光通常会观察到偏蓝的荧光发射，这称为原发荧光或自发荧光[7, 8]。天然存在的物质通常具有非常宽的激发和发射光谱。随着分子生物学的发展，研究已经集中在具有明亮荧光的特殊染料上，以区别于可能的自发荧光。用于选择性地对生物学上重要的分子进行染色的染料称为荧光染料。当与抗体或核酸偶联时，它们被称为荧光标记或探针。如今，荧光染料在光谱的紫色，蓝色，绿色，橙色，红色和近红外区域具有峰值发射。可以用橙色和红色光激发荧光染料，并用光电倍增管或荧光灯检测红色和红外荧光 CCD-相机的荧光显微镜技术已经超出了视觉范围。荧光染料的激发和发射可能会随着细胞环境的变化而变化。之所以选择某些染料，是因为它们的激发或发射光谱会随着细胞内介质中某些离子的浓度（例如钙，钠和pH值）的变化而发生变化。
落射照明荧光显微镜的早期发展
回顾荧光显微镜的历史，读者可以参考Kasten [11]。落射照明（垂直入射的激发光）已经被Policard和Paillot [32]。包兹的莱茨（Leica）制造了几种乐器&Lomb，Reichert和Zeiss，部分基于Ellinger和Hirt的建议[4, 5]，歌手[37]和Mehler并选择[16, 19]。 Haitinger描述了一种早期的Leitz（Leica）荧光落射照明系统[6]。有关落射照明荧光显微镜演变的更多详细信息，请参阅Rost [34]，并将其用于入射光荧光显微镜的早期应用[Hauser [7 ]。
落射照明荧光显微镜的主要贡献是引入了用于入射照明的双色镜。 紫外线 布伦伯格和克雷洛娃[2]。落射照明具有一定的光学优势，因为与透射照明不同，聚光镜和物镜具有独立的光轴，必须完美对准。物镜既用作聚光镜又用作聚光镜，避免了所有对准问题。使用二色性分光镜将激发光的荧光发射分离比使用透射光荧光显微镜要容易得多。但是，这些可能性并未使工业显微镜制造商普遍接受落射照明作为常规荧光显微镜。造成这种情况的主要原因可能是透射光暗场 紫外线 激发在荧光显微镜的大多数应用中已经获得了出色的结果[17]。其替换为 紫外线 Epi照明不会有明显的优势。直到六十年代后期，利用暗场聚光镜使用透射光仍然是工业标准。
然而，对分子生物学的迅速增长的兴趣导致了许多用于检测细胞中重要大分子的（单克隆）抗体的发展。为了研究几种大分子在细胞器中的详细形态学位置，越来越多地使用具有不同颜色的荧光标记。 紫外线 激发-传统上用于荧光显微镜-不适用于同时检测细胞中的多种荧光染料。
大约在1962年，Ploem开始与Schott合作开发用于反射蓝光和绿光的二向色分光镜，用于使用落射照明的荧光显微镜。在他的第一次交流时[1965年]，并发表了带有窄带蓝色和绿色光的落射照明[21]，他不知道有用于分光镜的分色镜的发展 紫外线 布伦伯格和Krylova用入射光激发[2]。 Leitz公司也不是，他从中获得了"Opak"带有中性分束器的落射照明器。该照明器必须进行修改，以在入射光路径中包含一个滑块，该滑块分别包含四个二向色分束器 紫外线 ，紫色，蓝色和绿色的激发光。由阿姆斯特丹大学开发的该设备允许在入射光路上轻松交换不同的二向色分束器（图 1a）。激发光的波长因此可以容易且快速地改变。
很快就清楚了，用窄带蓝光和绿光激发为检测广泛使用的免疫荧光标记荧光素-异硫氰酸酯（FITC）和四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）。蓝色和绿色激发的使用也使组织成分的自发荧光最小化，这是传统透射照明在 紫外线 光。 FITC 现在可以用窄带蓝光激发（使用半宽为16的带干涉滤光片 nm），接近激发最大值490 nm（长波长蓝色），清晰观察到520处的绿色荧光峰发射 纳米组织成分的自发荧光最小化（图 2a and b）导致高图像对比度。激发 FITC 接近其最大激发值就可以进行有效的激发，甚至可以使用在蓝色波长范围内没有强发射峰的水银高压弧光灯。此外，通过绿色反射二向色镜进行落射照明，首次实现了强汞发射线在546激发Feulgen-pararosaniline nm (Figures 3a and b).
在他的第二本关于多波长落射照明器的出版物中，描述了带有四个二向色性光束散射体的Leitz原型（图 1b), 隆[22]可以肯定Brumberg和Krylova [2]。在那个时期，俄罗斯研究的不可及性，以及在俄罗斯或东德，没有任何主要的落射荧光显微镜工业发展，这就是莱茨较早就不知道这种发展的原因。引入落射照明的可能性 紫外线 光线虽然对多种应用有用，但由于它们已经具有出色的透射暗场，因此并不是Leitz进行新技术开发的动力。 紫外线 激发可用。然而，常规免疫荧光显微镜在医学诊断和分子生物学研究中在世界范围内的日益广泛使用可能受益于使用蓝光和绿光的窄带激发进行落射照明的新可能性。由于可以使用标准的高压汞弧灯，因此这似乎是一个实际的建议。
随后，Leitz开发了一种新颖的多波长荧光落射照明器（Leitz PLOEMOPAK），该照明器分别具有四个旋转的二向色分光镜 紫外线 ，紫，蓝和绿光[13]。在连续几代的Leitz照明器（包含四个二向色分束器）中，添加了滤光镜和用于激发滤光镜的旋转转塔。最终，卡夫（Kraft）[15包含多组激发滤光片，二向色分束器和阻挡或发射滤光片的组合，并安装在滤光块中，也称为滤光块（图 4）。由于该照明器允许滤光片立方体迅速变成光路，因此对同一组织切片的多波长照明成为一个实际的建议。此外，用户可以更换照明器中的四个滤光片立方体（图 1c）。可以组装不同的四个滤光片组，从许多滤光片中选择，包含激发，势垒滤光片和二向色分束器的组合，这些滤光片是为不同的应用开发的。根据Ploem的建议，Leitz还生产了带有落射照明的倒置显微镜（图 5a and b）。有关用于多波长荧光显微镜的Leitz PLOEMOPAK照明器的评论，请阅读Pluta的评论[31 ]。
左：图4：用于荧光显微镜的完整Leitz（Leica）滤光片立方体（块），包含：激发滤光片，二向色分束器和发射（阻挡）滤光片。
Leitz（Leica）滤镜立方体系统是如此高效，以至于现在39 数年后，大多数显微镜制造商仍在使用类似类型的滤光片进行多波长荧光显微镜检查。这项发展最终促使Leica研发了可容纳八个滤光镜立方体（适用于各种波长范围）的自动多波长荧光落射照明器（图 5c）。在滤镜立方体之间切换时，可以避免计算机显示器上的像素移位或保持在低于35的分辨率下 毫米胶片归功于0像素移位技术。该照明器现在用于荧光原位杂交方法（鱼）研究染色体。
隆[24, 25, 26, 27, 28]，范德普洛格和普隆[20]以及Nairn和Ploem [18]进一步探讨了必须为许多生物医学应用开发的过滤器组合。这是与Schott和Leitz合作完成的。雷加德和奥尔森[35]开发了一种新型的短波高透射干涉滤光片，它对蓝光具有很高的透射率，并且对于波长大于490的波长具有很强的截止能力 nm.
隆[23]结合了 SP 带1的过滤器 mm GG Schott的455过滤器，阻塞了 紫外线 激发，并建议Balzers开发类似的滤波器（ SP 560 = KP 560）用于绿光激发，以及用于紫光激发的滤光片（LP 425 = KP 425）。后一种过滤器用于神经递质的研究[25]。在图 6a and b可以观察到产生的蓝色荧光。
从眼镜行业的角度来看，卡夫（Kraft）[14]，沃尔特[39, 40]，特拉普[38]和Herzog [8 ]。
在落射照明荧光显微镜中使用的主要滤光片类别如下：（a）初级激发滤光片LP（长通）和 SP （短通）-在德国文学中称为KP滤波器-和（b）辅助滤波器，例如势垒滤波器和发射滤波器[23]。后者也被描述为荧光选择滤光片。例如，这些用于将观察值限制为520的峰值荧光 nm of FITC。 Reichman [最近对荧光滤光片的滤光片进行了广泛的综述[ 33 ]。
Cormane [3]是第一个证明窄带蓝光落射照明的荧光标记 FITC 在人类皮肤疾病的免疫荧光研究中提供了最佳对比。透射光激发 紫外线 用于在皮肤中引起弹性纤维如此强烈的自发荧光的光，从而严重阻碍了荧光抗体的可视化。
莱兹（Leitz）在落射照明荧光显微镜方面的开创性工作是在70年代发生的，与此同时，免疫荧光和其他分子生物学方法如 鱼 在医学诊断和研究中。 Hijmans等。 [9, 10]率先证明新型Leitz多波长激发落射照明器使用与绿色荧光标记的抗体选择性检测细胞中某些类别的免疫球蛋白的有用性 FITC 和红色荧光TRITC。他们应用了蓝光和绿光两种波长的激发方法，并选择了荧光的峰值荧光。 FITC 在520由发射过滤器 nm (Figure 7). Brandtzaeg [1]和Klein等。 [12】在使用Leitz Epiilluminator的两波长激发下，在鉴定具有免疫学意义的重要细胞类型方面取得了类似的发现。在沾满鲜血的"rosette"形成，使用两波长激发法 紫外线 绿灯可以显示单个核细胞周围的红细胞（图 8).
Epi-illumination
在落射照明中，使用二向色分束镜将入射光偏转到样品上。二向色镜的光谱特性经过设计，使得只有所需的激发波长才能通过物镜向下偏转到样品上，而不需要的波长则由二向色镜透射并收集在光阱中[ 15在二向色镜后面。消除这种不需要的激发光会导致杂散光的显着减少，从而改善图像对比度。双色镜将所需的（短波长）激发光通过物镜偏转到样品上，但对较长的荧光波长透明。抑制滤光片（阻挡滤光片）吸收（或反射）从样品和物镜的镜片表面反射的激发光，但对荧光高度透明，因此可以到达目镜。落射照明的效率与物镜数值孔径（NA）的四次方相关，该物镜首先在落射照明中用作聚光镜，然后在聚光镜中观察。在销售第一批多波长落射照明器时，只有具有高NA（0.95，1.30）的高功率物镜（x70，x100）可用。遵循Ploem的建议[21, 22]，Leitz是第一家生产中等功率目标（如油浸x40物镜，NA为1.30）的制造商（图 9）。这种新型物镜，特别是为落射照明荧光显微镜设计的，可产生非常明亮的图像，从而在常规荧光显微照相中可实现较短的曝光时间。
右：图9：Leitz（Leica）早期（1967）原型（"Versuchs"）的油浸物镜x40（NA 1.30）是为荧光落射照明技术的试验而开发的。
物镜的入射光瞳（孔径）的最佳填充
落射照明荧光显微镜的一个问题是物镜的入射光瞳最佳填充了光源的图像。光源的中等放大倍率约为8 时代是典型的。这与各种高压汞灯和氙气灯的电弧大小不同有关。此外，物镜的入瞳也相差很大，例如3.6 x100，NA 0.90物镜和12的mm x10，NA 0.30物镜的毫米。此外，如果仅弧的一部分可以进入入瞳，则获得的荧光强度将降低。最近Schönenborn[36]报道了徕卡完全创新的入射光路 DM R (HCS ）显微镜。现在已经设计了落射照明的路径，以允许照明光路针对不同应用所使用的特定光源进行单独调整。假设在入射光路上有Koehler照明，照明光学系统和收集器的组合将在物镜的入射光瞳中成像光源。对于给定的物镜，光源放大倍数的选择直接取决于其几何尺寸。卤素灯的调整应该非常好，因为灯丝的线圈会对灯丝失调造成极高的敏感性。那么建议使用相对较低的放大倍数。
在某些应用中，荧光强度可以增加1.8倍，对于工业应用中的 紫外线 在DM范围内甚至达到3.5倍 R (HCS ）显微镜。的增加 紫外线 该范围得到了新型的经过特殊色彩校正的特殊高透射率玻璃镜片的6透镜收集器的支持。对于Leica 糖尿病 R (HCS ）显微镜系统现在提供两个模块：带HC的照明光学系统 F模块的放大倍数为11.5，对于HC 射频模块的放大倍数为4.8。另外Leica 糖尿病 R (HCS ）Epi照明支架与HC结合使用了一个额外的照明透镜 F模块在25 mm的视场中产生非常高的荧光强度和良好的均匀性。需要特别好的同质性的用户甚至可能会脱离HC的照明透镜 F模块，仅略微降低荧光强度。物镜瞳孔中光源的图像比例从11.5降低到大约9.5，导致增加约20 有用视野的百分比。为了进一步提高均匀性，可以将光学扩散盘插入模块中。有趣的是，已经观察到，当图像强度不是完全恒定而是稍微下降到图像边缘时，获得了用于观看荧光的最令人愉快的图像印象。这种作用是眼睛生理的结果（所谓的"lateral retardation"）。相反，具有图像分析功能的视频技术需要极其恒定的照明。这可以通过切换HC中的光扩散盘来实现 将RF模块转换为视频模式，从而在约16个中心场中实现更高的同质性 毫米（对应于1/2的面积"带电视适配器x0.5的相机）。
徕卡还进一步改善了荧光显微镜的物镜。具有低自发荧光性质的光学玻璃的选择导致图像对比度的增强。
荧光显微镜的一个问题是无法从相对较厚的样品中获得清晰的图像。这是由于使用高数值孔径的物镜，焦前和焦后平面对最终显微镜图像的有害影响。这样会导致图像清晰度不高。然而，Leica光谱共聚焦显微镜可以以高横向和垂直分辨率从标本中的几个焦平面获得高分辨率拍摄的清晰图像。
样品中多种荧光染料的分色已通过光谱分析得到了进一步改善。因此，计算机辅助光谱共聚焦扫描显微镜已成为生物医学和材料研究中荧光显微镜的终极工具。
过滤立方体可用于分子生物学中的各种应用
过去十年中，分子生物学应用的爆炸式增长导致了针对各种应用的许多过滤器组合的发展。现在，这些过滤器集安装在各种过滤器立方体（块）中。荧光落射照明器可以通过手动或电动更换来更换2-8个滤光片，例如荧光杂交研究中所需要的。本文无意对各种过滤器立方体支持的多种应用进行全面详细的讨论。相反，仅给出了过滤器多维数据集和关键字的示意图，指出了可能的应用（表1）。
表1：荧光显微镜应用实例
当在引用的论文中提及光学零件和荧光染料时，此处仅列出它们。该表中的语言和术语仅限于所引用论文的文本中使用的术语。斜体字列出了德语的过滤器名称术语。作者可以将频带干扰滤波器（BP）的半宽度称为+00或/ 00 纳米 ，表示中心波长和半功率带宽（例如BP 525/20）或短波和长波半功率点（例如BP 450-490）。短通和长通滤波器由字母标识 SP 和LP以及以nm为单位的边沿波长（例如 SP 490, LP 520 or >520 nm）。对于作者向光学部件制造商的参考，读者可以参考所引用的文献。
显微镜，物镜，大分子 | 氟 | 光源 | 二色性 | 排放过滤器 |
激光扫描显微镜（LSC）x20 | FITC | 氩激光 | 530 + 30纳米& | |
倒置荧光显微镜x40 | 何 | DCM激光 | FT 395% | 450 + 33纳米& |
数字荧光显微镜x100 / 0.60–1.32 SP （KP）630前面 CCD 相机可阻挡远红和红外光 | CY3 | 绿色515–560& | LP 580红色# | |
共聚焦荧光显微镜x60 / 1.4 | FITC | 氩气 +离子线 | LP OG 530# | |
数字荧光显微镜x63 / 1.4 | DAPI | 混合/氙气汞灯 | ||
荧光显微镜 | TRITC | 三重带通滤波器*（MBP） | 调频 % | （排放） |
荧光显微镜x100 / 1.35 | 磅 | 水星100 W |
| （排放） |
荧光显微镜 |
| 水星100 W |
| （排放） |
电动落射照明器x100 / 1.3 |
| 水星100 W | 四个过滤器立方体@ （FC） | （排放） |
倒置荧光显微镜 CCD | DAPI | 紫外线 | 排放 | |
数字荧光显微镜和（CCD）x40 / 0.75 |
| 多带通滤波器（MBP） | 三频（多色）分束器（PBS） ％〜 | 三频发射滤波器 |
带有电动落射照明器的荧光显微镜，延迟发光成像和 CCD，x63 / 1.32 | 级联BL | 水星100 W | A@ |
|
带有电动滤镜更换器的荧光显微镜和 CCD 相机 | DNA探针： | 血压 & 510/20纳米 | 三频（多色）分束器（PBS） ％〜 | 三重带通发射滤波器： |
荧光显微镜 CCD 相机 |
| 汞50 W | 三重带通发射滤波器 | |
荧光显微镜和 CCD 相机，x20 / 0.75 |
| 水星100 W |
|
|
显微镜用 CCD 相机x30 / 0.5 |
| 手动，用于荧光滤光片的六个位置滑块 | ||
使用多色分束器进行波长切换的落射照明显微镜专用光学系统 |
| 水星100 W | 多色PBS% |
|
*发射或激光线。
^短票 SP （KP）激励滤波器。
&窄带通（BP）激励滤波器。
~多带通滤波器（MBP）。
%二向色分束器（DBS）或二向色镜（DM）和
％〜 多色光束散射体（PBS）。
#屏障过滤器（LP）。
$发射带通（BP）干扰滤波器和发射多带通滤波器（MBP）。
@过滤立方体，块（FC）。
反射对比显微镜（RCM）
大多数免疫染色的强烈反射提供了很高的对比度，因此该染色可以与许多经典的（吸收性）组织化学染色相结合，用于显示中等强度反射的重要大分子。后一种染色剂通常可用于提供良好的形态学取向，并且在许多情况下，与仅使用荧光标记物相比，可以获得更精确的免疫标记物位置。此外，可以通过电子显微镜检查下一个超薄切片（具有相同的免疫染色）来确认这种光学显微镜的观察结果。 电磁 .
在共聚焦激光扫描显微镜中，由于通过针孔照明消除了杂散光，因此无需特殊的物镜或其他减少杂散光的光学措施即可执行RCM。大多数吸收性免疫染色会产生强烈的激光反射，并且褪色非常有限。它们通常允许使用较小的针孔尺寸（例如10微米），这比共聚焦荧光激光扫描显微镜中大多数荧光染料所使用的针孔尺寸小约五到十倍。因此，使用反射免疫标记可以导致光学分辨率的显着提高。标本用荧光染料和Leica光谱共聚焦激光扫描显微镜双重染色，为多种标记提供了新的可能性，可以轻松检查反射型免疫标记。
RCM使用荧光显微镜支架，落射照明器和高压灯。在荧光落射照明器中，必须插入一个额外的偏振滤光镜立方体，其中包含一个偏振镜，反射镜和一个检偏镜（图 12）。同样，反射对比度（RC）光阑模块（包含中央光阑系统）也必须带入入射光路。此RC膜片模块适用于带有中央挡块和/或光圈膜片的滑动装置。此外，为反射对比显微镜开发的特殊物镜Leica RC M计划油浸x100 / 1.25 在前透镜上装有λ/ 4板的RCM物镜应添加到物镜左轮手架上的物镜组（用于荧光显微镜）。
在反射光显微镜中，对比度基于反射强度（=反射率）的差异。在这种类型的显微镜中，应提醒注意的是，光的反射发生在每个光学边界处，即当折射率和/或吸收率发生变化时。对于反射率小于1的生物样本 ％，且大多数小于0.2 ％，由于显微镜管内部的有害反射，用常规显微镜几乎不可能获得反射光图像。在反射对比显微镜中，两种方法的组合用于减少由于散射光引起的眩光。通过在与后焦距（孔径）平面共轭的平面上的入射光路中插入中央光阑（带有中央光阑的孔径光阑，形成一个环形光圈），使入射光变成环形光锥。目标。作为第二种方法，通过使用"antiflex"方法。使用交叉偏光镜可抑制显微镜内部反射的光，结果只有从样品反射的光才能传递到眼睛。为此目的，在物镜的前透镜中为物镜提供了一个四分之一波片。光穿过λ/ 4板（向下到达样品，并在样品反射后向上），使光的偏振方向变为2 x 45° = 90°.
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Source
科学技术信息CDR 5：1–16（2001）