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新的标签工具可以帮助实现超分辨率显微镜的全部潜力

Aptamers实现小亚细胞结构的敏感和准确标记

由于超分辨率显微镜技术通过克服物理衍射极限而彻底改变了光学显微镜的概念, st 显微镜和其他超分辨率技术引起了相当大的兴趣。衍射限制对分辨率没有更多的限制。正在开发具有不断降低的分辨率限制的新显微镜,例如通过发明人 st 显微镜,斯特凡地狱教授,现在是德国Göttingen的Max Planck生物物理化学研究所所长。标签现在施加限制:如何标记,以及如何?

来自哥廷根大学神经和感官生理学部的Silvio Rizzoli教授发现,一定类别的小分子具有用于超分辨率显微镜中的标记探针的理想性质。第一个与Stefan Hell在生物应用中合作的科学家之一 st 显微镜,Rizzoli有令人兴奋的事情来讲述他的过去和现在的工作。

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具有当前标记探针的STED显微镜

标签的早期挑战是发现适合的荧光染料 st 通过激光激光激发的显微镜,并被刺激发射激光去激发。到目前为止,化学家产生了足够数量的合适化合物来考虑解决这个问题。但是第二个标签问题仍然存在:标记探针的总大小。

抗体的分子量为150 KDA和10-15的长度 nm,初级和二抗的组合达30 nm long。在使用300的传统分辨率时,这不是问题 NM,但分辨率为20-40 nm,这个尺寸的标记探针当然会造成问题:首先,荧光团最多可达30 NM远离他们的目标和第二,因为空间约束,探针不会与每个目标分子结合,并且图像往往变得斑点(图 1).


右:图1: st 显示通常通过超分辨率显微镜中的抗体染色产生的工件的图像。神经细胞 - 已知是连续结构 - 在人神经母细胞瘤细胞系中与小鼠抗O-糖基化的神经嘧仑M IgG免疫染色。来源:细节 Wildanger等。 (2009).

适体 - 用于STED显微镜的新标记探针

Felipe Opazo.,Silvio Rizzoli集团的博士后研究员,与国际合作者的合作,单链寡核苷酸,称为适体(来自拉丁文) Aptus. - 适合和希腊语 meros. - 部分),非常适合此目的(Opazo等人。 [2012])。这些寡核苷酸长度为15-100 在体外制备核苷酸 - 合成的超像PCR的引物 - 并且在溶液中呈现具有与其他结构的结合亲和力的溶液中的特定三级结构(图2)。由于这种性质,适体仍然被调查为潜在的药物物质,例如抑制疾病相关的蛋白质。

适体比抗体或抗体片段更轻,小于抗体或抗体片段(Fab碎片:Ca. 50 kDa, length ca. 9 nm),分子量为10-15 KDA和长度下降到2-3 纳米。这足以让毫无疑问,在决议下没有问题 超分辨率显微镜中NM或更少。它们的小尺寸使得几乎可以标记所有抗原,即使在仅存在少量抗原的情况下也是如此。例如,一些突触囊泡可能仅包含10个 每个囊泡的抗原。囊泡大小为45 nm,没有10个空间 antibodies, but 10 适用者很容易容纳。这导致细胞器中的标记密度更高(图 3).

为了找到针对目标结构的适体,选择来自寡核苷酸文库的适体用于结合目标结构。然后通过PCR扩增发现的适体并检查特异性。

Aptamers的一个优点已经很明显:可以在没有动物或细胞培养设施的情况下很容易地选择和生产。开发成本估计为2,000到4,000之间的范围 €。一旦确定序列,就可以在体外生产大毫克相适体的少量欧元。

此外,可以选择适体以结合特定的细胞类型,例如,即使在不知道其实际结合伴侣的情况下,癌细胞也是特异性癌细胞。由于抗体,这是不可能的,因为不能用全细胞免疫动物。

与单克隆抗体类似,适体通常仅识别固定或天然蛋白质,这取决于它们的选择。

使用Aptamers作为标签探针的主要挑战是确保特异性。很容易找到与目标绑定的适体,但对特异性的测试需要时间和金钱。

真正的结构揭示了

Silvio Rizzoli.组使用的适体来测试使用这些分子的可行性 st 在纽约州阿尔伯特爱因斯坦医学院和奥斯汀的德克萨斯大学和德克萨斯大学的两个美国研究小组开发并用于合作,具有数十年的使用和开发适体的经验。它们使用适体为内体组的三种蛋白质 - 一种涉及物质吸收到细胞(内吞作用)的细胞内细胞器 - 并将获得的图像与用抗体与相同蛋白质的抗体获得的结果进行比较,并用标记的天然配体获得的结果。

当使用适体对内体的蛋白质的蛋白质,典型的圆形内体结构在100到500之间的直径 nm可以可视化( 图4. )。通过针对相同的表位的单克隆抗体,这种结构难以检测:而用抗TFNR和表皮生长因子受体(EGFR)发现的内体状结构的数量与用标记的天然配体转移素的数量紧密相对应。表皮生长因子(EGF),用单克隆抗体发现的这种结构的数量要低得多。

通过适体,可以看到甚至可以看到诸如富含转移素受体(TFNR)的细细胞小管(TFNR)的细节(图 5).

Live imaging

使用小标记探针如适体,可以可视化更小的结构。并且由于其尺寸较小,探针也可以通过活细胞更容易地吸收,使实时成像成为可能。 Rizzoli和同事用抗异质蛋白的适体孵育培养的细胞,并且能够表明它们与内体标记alexa488-转铁蛋白和罗丹明-EGF共同定位。

适体识别的大量表位导致非常明亮的染色,允许实时时间流逝超分辨率成像以显示内骨动态。

Better sensitivity

适体染色也比抗体染色更亮。通过将用适体或抗体染色所获得的图像的整体染色强度与单一适体或抗体的荧光强度进行比较,Rizzoli和同事能够估计测试的适体识别出多于抗体的更多表位。 EGFR适体识别出大约两倍的表位,而与PSMA抗体相比,抗前列腺特异性膜抗原PSMA的适体识别出表位数的100倍。这使得较小尺寸的适体尺寸使得它们能够访问更多表位。

小,但只是多么小?

使用较小的标记探针显示了关于准确性和敏感性的预期效益。但是标签应该多么小?较小,更好?使用Aptamers,可以轻松修改标签探针的大小以解决这个问题。这是通过将额外的核苷酸偶联到结构上来完成的。将原始PSMA适体尺寸加倍15 kDa to ca. 31 KDA大大降低了图像质量,并将其增加到CA. 58 KDA导致质量进一步下降。因此,似乎只有最小的探针提供足够精确的图像。

骆驼抗体(纳米型)

由Silvio Rizzoli和其他群体测试的另一类小型标记是所谓的纳米级。 Nanobodies是从骆驼(Llamas和骆驼)获得的单链抗体,其分子量为CA。 13 kDa (length ca. 2 to 4 NM),即在与适体相同的尺寸范围内。纳米体生产开始类似于正常抗体产生的,具有与抗原的动物(通常是骆马)的免疫。几周后,血液取自动物,分离B细胞,选择特定的纳米甲基叠,并测定它们的序列。然后,可以在细菌中重组生产纳米氧化物。

纳米体的开发成本估计为8,000到10,000之间的范围 €,在单克隆抗体的成本范围内。一旦纳米敌人序列是已知的,它们可以通过细菌产生,仅留下标记成本。纳米级似乎更适合固定样品,而Aptamers可能更适合蛋白质复合物或复杂的蛋白质。

适用者的其他应用程序

对适体的更多显微镜应用是可能的:根据Silvio Rizzoli,它们可以例如用于ATP或其他化合物的传感器,用于不同类型的 烦恼 甚至它们在电子显微镜中使用的实验,正在测试与金颗粒中的电子显微镜。

目前正在调查适体作为癌症治疗的潜在工具。例如,可以针对特异性癌细胞或特异性表达癌细胞表达的受体来选择适体。如果那些适体与毒素或放射性核素偶联,它们可以注射到循环中,特别是癌细胞结合并杀死这些细胞。

第二种可能在肿瘤中的适体应用是它们用于诊断目的的用途:由于它们提供更敏感的染色,这可能导致活组织检查中的更好的癌细胞检测,并且也可能允许使用较小的活组织检查。

个人亮点和观点

Silvio Rizzoli.是第一个合作的科学家 st 显微镜。询问了他的个人亮点他的工作 st 在过去几年中显微镜检查,他提到了三个里程碑:

在第一次生物学应用中 st microscopy (Willig等人。 [2006]),Rizzoli,Stefan地狱和来自哥廷根的同事 st 表明synaptotagmin i,来自突触囊泡的膜蛋白,在用突触膜融合囊泡后保持聚集。由于突触囊泡的尺寸较小(CA.40 NM直径)和囊泡内分子的密集包装,这对于使用常规的荧光显微镜是不可能的。

其次,获得用的第一个活细胞视频 st microscopy (Westphal等。 [2008]),Rizzoli,来自Göttingen的地狱和同事获得了一系列失期系列 st 视频速率的图像显示活细胞中突触囊泡的运动。

和Silvio Rizzoli的第三个个人亮点是第一个发布 st 图像接近生物现实,通过使用适体作为标签探针(Opazo等人。 [2012]), 如上所述。

现在,用新的小标签探头最佳地适用于超分辨率显微镜的高分辨率,充分潜力 st 最终能够实现生物应用的显微镜​​检查。

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