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无像差显微镜光学元件相互作用的优化

谐波分量系统– HCS

光学显微镜用于放大人眼看不见的物体。为此,需要高质量的光学元件以实现适当的分辨率。但是,除了有意的影响之外,所有光学组件还对光具有有害的固有影响,从而导致像差。本文重点介绍了此过程中涉及的光学元件及其物理参数。在此基础上,它提供了有关如何应对像差减少的哲学的历史回顾。将显微镜视为一个整体系统是有益的,从而可以协调其组成以获得最佳的显微镜效果。

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Introduction

成像 光学显微镜 系统受以下因素影响 像差 由其组成的组件生成。例如,球差,彗差和轴向色差以及横向色差和像散会干扰图像。幸运的是,已采取措施将这些影响降到最低。

传统上,制造商试图消除产生它的组件上的像差。多年来,哲学发生了变化,光学开发人员开始考虑将显微镜作为一个整体系统。 1992年,徕卡显微系统公司将这一愿景变成了一个名字- 三角洲 系统,这是普遍的 无限光学 透射和入射光显微镜系统。它允许所有用户无限制地模块化使用所有光学对比技术 [1].

继续这种系统理念, HCS谐波分量系统 –是DELTA系统在1998年的进一步开发,至今仍在应用。它的突出思想是整个显微镜系统的所有组件之间的“和谐”。在保留基本目标和功能的同时, HCS 使DELTA系统变得更加通用,并开放它来满足用户的需求并解决特定的问题。

HC系统包含以下光学组件,它们相互匹配以生成最佳图像,并参与了光学像差的校正:

目标, 目镜, 管镜相机适配器.

自1990年代以来,它的实施仍然影响着最近的显微镜。 模块化 现代研究显微镜的高度依赖于所有光学成分的协调(图1)。

光学和机械配件尺寸的协调

在发展的过程中 无限光学,“长”(直到1987年冶金显微镜的参考焦距为250 mm)和“短”(管长为160 mm)积累了深厚的技术经验。 参考焦距 并对它们的优缺点进行了严格的分析。随着1992年引入DELTA概念,参考焦距 200 mm 被定义为徕卡新标准,以实现整个系统高效设计的最佳长度。这个概念和谐地融合了以前系统的优点,同时消除了它们的系统缺点 [1].

1858年,伦敦显微学会采用了经典的RMS(皇家显微学会)物镜螺纹作为显微镜的标准螺纹。无穷远光学的发展和用户要求的变化(例如,光学显微镜)。荧光显微镜对高孔径物镜的需求不断增长,这表明RMS螺纹将阻碍进一步的发展。为了创造新的自由度,徕卡推出了新的 M 25x0.75物镜螺纹 在1992年采用DELTA系统。

在DELTA系统的开发过程中,还研究了物镜新的更大的焦距的必要性和可能的​​优势。

共焦距离 d是纯机械尺寸,即物平面和物肩之间的距离(图2a)。当通过旋转镜架改变物镜时,或多或少地保留了图像焦点(共焦)。除了确定用于集成透镜元件的空间量外,共焦距还影响物镜和整个显微镜系统的结构和人体工程学设计。

尽管较长的焦距(例如60 mm或更大)在显微镜和宏观显微镜之间的阈值范围内设计物镜具有某些优势,但对于整个显微镜范围的技术和应用均衡设计却具有相当大的缺点。

除了增加物镜和后续光学模块的尺寸(会引起许多用户的不赞成)之外,更长的焦距也对人体工程学产生不利影响。立式显微镜的观察口和倒置显微镜的样品台位置不可避免地与共焦距的增加成比例增加。

的位置 后焦平面 物镜(出瞳)在后续镜筒的校正中以及在位于物镜和镜筒之间无限光路中的图像对比模块的光学和几何设计中都起着重要作用。焦化距离越长,出射光瞳与随后的光学元件之间的距离越长,从而导致更大的直径,校正问题,更高的成本等。更长的物镜焦化距离通常会提高物镜的对中灵敏度 [2],这对于高性能物镜尤其不利(图2b)。

在仔细分析并考虑了均匀显微镜范围的所有关键方面之后,徕卡决定继续使用 焦距为45 mm,已经证明了DELTA光学系统的最佳解决方案。这些配件尺寸继续用于 HCS 该系统可确保对整个“显微镜工作场所”的光学,机械和人体工程学要求进行协调的回答。

Harmony in Imaging

所描述的机械和光学装配尺寸定义了用于成像和校正光学像差的光学组件组成的几何框架。

所涉及的每个组件-物镜,目镜,套筒镜,相机适配器等-都有不同的物理工作要做,因此对纠正物理上不可避免的问题有其自己的特定要求。 光学像差。已经详细描述了需要校正的像差的因果关系 [1].

显微镜已采用各种方法进行“整个显微镜系统”的光学设计,并将校正工作分配到相关组件之间。

首先,将每个组件设计为本身没有像差的方法似乎很有吸引力。尽管从原则上讲这是可能的,但它存在纠正“过载”的风险:成本太高,达到或超过了可能的极限。


事实证明,更好地整体观察整个显微镜系统的某些光学像差的校正并在多个系统组件之间分配影响。


球差, 昏迷轴向色差 从源头(即它们起源的组件)​​有效地进行了纠正。但是,很早就发现,通过将校正工作委托给物镜和目镜,可以最好地校正横向色差和像散。 [3]。自从引入无限光学以来,每台显微镜都具有镜筒系统,这是形成真实中间图像所必需的。正如我们已经描述的,该系统可用于在中间图像中建立特定的校正状态 [4],创造更多的自由度。

随着DELTA光学器件于1992年推出, 物镜横向色差的补偿从目镜转移到了无限远镜筒 。这是通往世界的另一重要步骤 HCS 系统,为设计广角目镜带来特殊优势。

在光学成像中 散光 这个名称是为以下典型现象命名的:在径向或切向方向上延伸的离轴标本细节以不同距离聚焦,即聚焦在凸矢状或子午像面上。消除散光后,它们会重合在一起,形成简单的图像表面(在简单情况下也是凸的) 场曲)。在理想的光学系统中,没有像场弯曲和像散的像面位于高斯像面上,并且标本的细节清晰地聚焦在整个视场中。

散光校正后的剩余场曲率主要取决于所使用物镜的类型。物镜的构造越复杂,场曲越小。散光的程度尤其受镜片形状的影响。简单类型的目标,例如 消色差 当满足非球面矫正的基本要求(即球面像差和彗差的矫正)时,总是有一定的剩余散光。使用简单的经非球面校正的目镜,就有可能以“自然”方式获得足够的成功来补偿这种残留的像散。

尽管没有目镜参与,但只有通过开发更复杂的平面物镜,才可能对剩余的场曲进行额外的校正。但是,经验表明,将曲率和像散校正工作更均匀地分配到所涉及的各个组件(包括管状透镜)中,将更为有益。这已经发生了 HCS 系统(图3)。

具体而言,这意味着物镜对场曲校正的部分贡献将由以下组件的共同补偿工作量承担。这使目标“更加放松”,并为特殊应用创造了更大的自由度。

技术与应用的和谐

不仅显微镜组件之间相互协调,而且它们与相关应用程序相结合。特别是目标可以根据其任务进行定制。主要是由于荧光的应用,除了出色的场平坦度和色校正之外,还需要高UVA透射和低自发荧光。

对比度,场展平

目标质量的公认标准是 斯特列尔强度比,给出了像差物镜形成的图像在衍射盘中心的强度与相应强度的关系,该强度在其他方面相同但理想地校正了 [5]。该值的大小对于图像对比度起决定性作用。在光学设计中,瞄准并实现了图像中心的99%的Strehl强度比。为了满足最高要求,对于高性能目标,制造公差一定不能使该值降至95%以下。关于该主题的文献允许根据人眼的生理特性,使斯特雷尔强度在像场边缘下降至80%。

点扩展功能(PSF) 用于自发光点的艾里衍射图样中强度分布的可视3D显示。中心最大值的高度(强度)和宽度取决于孔径。 斯特雷尔强度仅用一个数字描述物镜的性能,而PSF则提供有关残余误差的程度和性质的信息。 因此,可以容易地区分球差,昏迷和散光。

该图案越高越细,对比度和分辨率就越高。如果存在像差,则强度在中心最大值处下降,而在衍射环中上升,从而导致对比度降低。除此之外,旋转对称性以及因此成像精度朝图像边缘减小。

图4显示了通过 HCS 系统以40倍物镜的典型示例为例。

工作距离以适合应用

有时候,高空油浸物镜的特殊性能是突出了更长的自由工作距离。然而,在实践中,通常假定的优势是不利的。

具有很高孔径的油浸物镜仅在相对狭窄的温度间隔内才能达到其全部光学性能,这是因为浸油的折射率随温度的突然变化。从图5可以看出,油层越厚,折射率的温度特定变化对图像的损害越大。因此,为了可靠地应用,自由工作距离必须与实践中通常出现的温度间隔相匹配,即,远大于0.1mm的自由工作距离是不合适的。

适合应用的CORR目标

中的一些目标 HCS 该系统配备了校正支架,即使在特殊条件下且样品中的光学条件发生变化时,也可以实现物镜的光学性能潜力。在设计物镜时,校正中要考虑到有关盖玻片和浸没介质的厚度和折射率的某些假设。

如果条件与这些假设不同,则会发生球差,从而导致对比度下降。可以通过计算得出的镜头组间距的变化来纠正此故障。可以更正以下内容:

  • 防护玻璃厚度与标称值的偏差(图6)

  • 不同的浸入介质

  • 浸没介质的温度偏差

  • 聚焦在表面以下时样品的折射率影响

电生理学目标

在电生理学中,细胞通过 微操纵器 在温控水溶液中。例如,在恒定温度下测量神经细胞的最小电流和电压。这对物镜的机械性能提出了特殊要求(图7),例如

  • 纤巧的安装座,具有尽可能大的进入角度
  • 整个前部均具有惰性,防刮擦的表面
  • 最小的表面电导率
  • 最小导热率

光学设计还必须满足特殊要求:

  • 自由工作距离长
  • 宽带 APO 校正400 – 1000 nm
  • 迪克 在里面 近红外 厚样品中由于杂散光影响而产生的范围
  • 紫外线-荧光透射
  • 最小自发荧光
  • 共聚焦显微镜的适用性

为了满足该应用领域的特定需求,专门设计了一系列目标。在这里, HCS 该系统可以调和光学性能要求方面相互矛盾的极端情况。

HC 目镜

我们已经讨论过横向色差 [1]。在目镜中,它不会像物镜那样朝着像场的边缘线性增加(“区域行为”)。先前使用的目镜的子午和弧矢图像曲线也显示了类似的非线性行为。相反,物镜的相应场曲是“无区域的”。这种矛盾的行为难以协调,即,尽管熟练地与大图像场进行了调和,但仍保留了一定数量的散光。 在里面 HCS 目镜系统已从物镜接管了较大比例的曲率校正。 这项任务导致了更复杂的目镜类型,具有更大的自由度,可用于校正像差和像散等剩余像差。因此,HC目镜可对场曲线进行“无区域”校正。

Summary

多年来,随着显微镜的发展,值得将显微镜视为一个系统。随着1998年HC系统的引入,Leica Microsystems进一步发展了这一愿景,直到今天仍然有效。它的技术概念基于1992年随DELTA系统引入的光学和机械装配尺寸,用于焦距,物镜线和参考焦距。

HC系统构成了 协调系统组件之间的光学校正效果 参与。这使得有可能保留光学系统的通用应用潜力,同时设计可额外满足特定应用要求的物镜。荧光和共聚焦显微镜或电生理学。

References

[1] Schade,K.-H.,Euteneuer,P.a. Müller-Rentz,A .: Delta-来自的新型显微镜光学系统徕卡,科学技术信息,第一卷。 X号4,第114–122页,1992年。

[2] 哈弗科恩(H. Optik,Verl。约翰·安布罗修斯·巴特(Johann Ambrosius Barth),莱比锡,1994年。

[3] 梅斯(美国): 重铬酸钾盐的新碱土希望。 米克尔你F。 mikr。技术37,S。49-52,1920。

[4] Schade,K.-H.你克莱因(W.): 用于无限长管的光学系统–有什么优势?科技信息卷。 第六,第5期,第185-191页,1975年。

[5] Beyer,H .: Handbuch der Mikroskopie,VEB Verlag Technik柏林,1973年,第91页。

[6] ISO 8255/1 – 1986: 光学和光学仪器–显微镜–盖类–第1部分:尺寸公差,厚度和光学特性,第一版– 1986-09-01。

[7] Hell,S.,Reiner,G.,Cremer C.,Stelzer,E.H. K .: 共焦荧光显微镜中由折射率不匹配引起的像差,J。Microsc。,第169,S. 391–405,1991。

[8] 克鲁格河: 新型Leica DM R的对比技术 HCS 显微镜系统,科学技术信息,信息 CDR 1,第37-46页,1988年8月。

[9] Schönenborn,J .: 新型Leica DM R中的照明光学元件 HCS 显微镜,科学技术信息,信息 CDR 1,第25至36页,1988年8月。

[10] Schade,K.-H.:光学显微镜:技术和应用,Landsberg / Lech; Verl。 1993年,现代工业。