Story

仔细阅读TEM薄部分自动染色的替代方案

染色后乙酸铀酸酯替代染色后

透射电子显微镜的对比度( TEM )主要由试样上的电子散射产生:强烈散射电子被称为电子密集的结构,并且在明场图像中显示为暗区域,而散射较少的电子显得亮(电子透明)(Flegler等人。 ,1993)。

为了增加对比,可以将电子致密污渍添加到样品中,最常用的重量是:金,铂,钨,铅和铀。生物样本可以通过各种染色技术对比:蛋白质复合物或病毒的颗粒可以嵌入重金属盐(阴性染色)中,或者可以用非常薄的电子 - 密集的金属膜覆盖(通过阴影产生的复制品)覆盖样品。在嵌入(十氧化锇或乙酸铀酰染色染色铀酰染色)之前,可以用污渍渗透细胞和组织,或染色超薄部分(Dykstra,1992)。本文讨论了所谓的后一种方法的试剂的选择。

Authors

话题 & Tags

最常使用的后染色方法是用乙酸铀酰(UA)染色的Twostep程序,然后柠檬酸铅染色。乙酸铀酸盐用作饱和溶液的水性或醇溶液,饱和溶液在3.5至4.0的范围内。添加醇,尤其是甲醇,增加了溶解度(Hayat,2000)。乙酸铀酰强烈染色蛋白质以及核酸和磷脂。当乙酸铀酰染色后施用时,柠檬酸铅(根据Reynolds,1963年制备)将增加这种对比(Dykstra,1992)。染色可以手动或自动进行,两种技术都具有它们的优点。对于手动染色,栅格漂浮,切开,在乙酸铀酰溶液的一滴10分钟上。在染色污渍后,将栅格用水彻底冲洗,以除去任何残留的未结合污渍。这第一步之后是5分钟。通过相同的程序铅柠檬酸染色。试剂的消耗很小,而努力相对较高。

或者,可以自动化后助化。这确保了更高的再现性和时间,但使用的试剂量较高。使用自动对比装置 EM AC20 (Leica Microsystems,维也纳)允许每次运行同时染色多达20个网格,无需为环境和用户提供安全保障。虽然UA是一个优秀且特征良好的污点,但由于几个原因,寻求更换的替代品。

当需要作为粉末处理时,如果吸入,它是非常有毒和致癌的。此外,还脱掉乙酸铀酰乙酸酯被认为是放射性物质,因此受相关规定。因此,UA需要足够的储存和仔细处理,这反过来增加了运输和废物处理的成本。为了最小化联系方式,许多用户优选使用AC20的自动版本,特别是随着易于制备的解决方案,可以避免固体UA的处理。

作为UA的替代品中描述的文学中描述的两种试剂引起了我们的注意:乌龙茶提取物(葡萄酒)和铂蓝。只有很少的数据发表了关于它们的,并且该方法在其中不公知 em. 社区。因此,我们已经用手动对比度进行了测试,并且第一次使用 徕卡EM AC20 instrument.

为了允许直接比较来自不同的后染色技术的结果,使用相同的样品进行所有测试:用2.5mmol / L硒磷酸盐缓冲液中的2.5%戊二醛将肝组织用2.5%的戊二醛固定,并用2.0后固定。 %锇十字氧化物。将组织脱水并嵌入琼脂100环氧树脂中,并截起于70nm的标称厚度。如下所述进行后助药。除了与UA结果的对比效率和可比性外,还评估了许多其他重要参数。

Oolong tea extract

Sato等人被描述为电子显微镜后染色后。 (2003),并用于少数研究(Sato等,2008; Miller和Simakova,2010)。根据Rumpler等人。 (2001年),OTTE是一种半发酵茶,作为食品制作。因此,即使供应商未能生产材料安全数据表,也被认为是无害的健康和环境。它可以从TED Pella购买(http://www.tedpella.com),并作为粉末递送。根据Sato等。 (2003),对蛋白的多酚组分与肽键反应。与素反应和柠檬酸铅的反应,导致对比度的增强。

在用不同的蛋白浓度测试后,溶解在沸腾的DDH中的0.2%蛋白2o用于进一步的实验,如Sato等人已经提出。 (2003)。与醋酸铀酰常规染色相比,葡萄牙铅柠檬酸盐的手工施用和随后的染色步骤更耗时(表1)。 Leica上的最佳结果 em. 在室温下使用扩展程序获得AC20(表2)。

标签。 1:手动染色程序的详细信息

染色1 时间 洗涤 染色2. 时间 洗涤
ua 10 min 2分钟ddh. 2O柠檬酸铅5 min 2分钟ddh. 2O
遗料 25 min 6分钟DDH. 2O柠檬酸铅5 min 2分钟ddh. 2O
Pt蓝色 10 min 2分钟ddh. 2O柠檬酸铅5 min 2分钟ddh. 2O

标签。 2:徕卡的自动染色程序 em. AC20。徕卡提出了UA和铅柠檬酸铅的条件,可以在染色装置的用户手册中找到。

染色1 时间 洗涤 染色2. 时间 洗涤
ua 30 min2分20秒DDH2O柠檬酸铅7 min2分20秒DDH2O
遗料 40 min 5分钟DDH. 2O柠檬酸铅7 min 2分钟ddh. 2O
Pt蓝色 30 min2分20秒DDH2O柠檬酸铅7 min2分20秒DDH2O

在手动和自动染色的样品中,浓度为0.2%的OTE表明,即使它明显低于UA(图1和2),也可以增加对比度增加。在我们手中,比与UA更频繁地观察到污染,这主要构成了较低的镁阳离子的问题。尽管延长了洗涤步骤,但都有手动染色或徕卡 em. AC20,无法消除此问题。

图1:相比之下,具有UA,OTE和PT蓝的手动后灭员程序的结果,其次是柠檬酸铅。在相同的条件下获取所有图像,并以类似的对比度增强再现,以允许直接比较所获得的对比度。 (a,左上左)未染色的小鼠肝组织。 (b,右上)常规 em. 染色显示了所有细胞细胞器的良好和一致的对比。 (C,左下方)在陶醉组织中清楚地看到包括核和粗糙内质网的细胞器。 (D,右下)Pt蓝色染色部分显示出良好的对比度。与UA相比,染色在线粒体和糖原颗粒中更强烈。秤栏:1μm。

图2:使用徕卡使用leica自动染色和Pt蓝色染色后小鼠肝切片的比较 em. AC20。 (a,左上角)未染色的组织。 (B,右上)UA染色肝组织显示出整体良好的对比。 (C,左下方)对比剂量较弱,染色肝组织和轻微的污染是可见的。 (D,右下)核,粗糙的内质网,线粒体和糖原颗粒在用Pt蓝(1:200)染色的该样品中清晰可见。秤栏:1μm。

Platinum Blue

用Inaga等人用作薄膜后乙酸铀酰基乙酸铀酰的替代品。 (2007; 2009)。该化合物是Cisdichlordiamineplatinum(II)与胸苷的反应产物(Inaga等,2007)。试剂可以直接从日本生产商Nisshin订购(http://nisshin-em.co.jp)。 Pt Blue是一种有害物质,可能导致眼睛刺激,癌症和对生育的影响以及骨髓,肾脏和神经系统的严重疾病(MSDS NISSHIN)。已发现市售6%的股票解决方案在手动染色的稀释度和1:200的稀释效果中得到良好的效果,用于自动化程序。手动染色方法的孵育时间与UA染色相同(CF.表1)。

用于使用染色 徕卡EM AC20,Pt蓝色的步骤延伸至30分钟,使用与UA相同的条件。然后将栅格用蒸馏水冲洗,用柠檬酸铅染色,并如表2中所述洗涤。图1和2说明了所有细胞器表明,所有细胞器都显示出良好的对比度,结果与从uA染色的部分拍摄的质量相当。在更强烈地染色的线粒体基质和糖原颗粒的更高对比度中可以发现差异。与UA相比,核糖体显得较弱。

Conclusion

评估剂和PT蓝色被评估为UA的替代品,用于电子显微镜的染色后染色效率,毒性,处理和价格。手动以及徕卡的自动染色程序 em. AC20经过测试。没有进行ZHOC染色。此外,除琼脂100或不同截面厚度之外的树脂可能导致不同的结果。

用特写获得的对比度以及样品上观察到的污染既不令人信服,不符合手动染色和徕卡 em. AC20。两种方法都有PT蓝色的结果明显更好。然而,必须考虑与UA相比对比度特性的轻微差异以解释显微照片(Yamaguchi等,2010)。可以从自动染色获得的结果质量与OTE和铂蓝色的手动程序相当。

关于毒性,这两种试剂都测试为UA的替代品具有不受放射性的优点。此外,可以避免使用健康损坏可吸入粉末。作为一种食品,可以推测,食剂是非危险的。相比之下,Pt蓝色是有毒的,但随着储存解决方案递送,进一步的危险处理可以减少到最低限度。利用诸如徕卡的自动染色装置 em. AC20可以帮助进一步最大限度地减少与有毒试剂的接触。

与UA和PT蓝色染色在时间和劳动力上是可比的,而与OTE的对比度更加耗时,而不会随着令人满意的结果而产生。和我们一样 徕卡EM AC20,可以一次染色高达20个网格,并且自动进行所有步骤,这变得越来越少。从经济角度来看,OTE是迄今为止最便宜的产品。使用的浓度为0.2%的每格的价格为显着低于Pt蓝(稀释1:100)和2.0%UA溶液。

总结,需要替代UA的电子显微镜,用于染色后染色,以非常便宜的价格和中等结果 - 乌龙茶提取物 - 和另一个,乌龙茶提取物的最小风险是一种试剂,可提供非常令人信服的结果,但成本更高,而不是没有安全风险 - 铂金蓝色。这里的实验表明,这适用于手动以及与自动染色
徕卡 em. AC20.

Acknowledgements

作者谨此感谢Yanli Tong(Leica Microsystems,Shanghai),以获得获取试剂和Jean Trichereau(IMBA,维也纳)提供样品。 N.F.,M.B.的工作。和g.p.r.通过卓越的格兰特景点,维也纳/ Zentrum Fuer Innovation Und Technologie的支持得到了支持"分子和细胞中心
纳米结构".

References

  1. MSDS NISSHIN: http://nisshin-em.co.jp/home/msds/index.html.
  2. Dykstra MJ:生物电子显微镜:理论,技术和故障排除。纽约(1992年)的全部媒体。
  3. Flegler SL,Heckman JW JR,Klomparens KL:扫描和透射电子显微镜:介绍。 W.H.弗里曼和公司,纽约(1993)。
  4. Hayat MA:电子显微镜的原理和技术:生物应用。 4. TH. 编辑。剑桥大学出版社剑桥(2000)。
  5. Inaga S,Hirashima S,Tanaka K,Katsumoto T,kameie T,Nakane H,Naguro T:低真空扫描电子显微镜用于石蜡切片,利用铂蓝细胞和组织的差异空泡性。弓培养醇Cytol 72:2(2009)101-106。
  6. Inaga S,Katsumoto T,Tanaka K,Kameie T,Nakane H,Naguro T:铂蓝作为乙酸铀酯中的替代透射电子显微镜染色。弓培养醇Cytol 70:1(2007)43-49。
  7. 米勒AA,Simakova AV:基于微孢子蛋白酶综合体(原生动物:microclowia)的超薄部分染色方法的应用。细胞和组织生物学4:1(2010)109-115。
  8. Reynolds ES:在高pH下使用铅柠檬酸盐作为电子显微镜中的电子不透明染色。中国细胞生物学17(1963)208-212。
  9. Sato S,Adachi A,Sasaki Y,Ghazizizadeh M:乌龙茶提取物作为乙酸铀酸铀酸染色中的替代。显微镜229:Pt 1(2008)17-20。
  10. 佐藤S,Sasaki Y,Adachi A,Dai W,Liu XL,Namimatsu S:使用乌龙茶提取物(葡萄酒)来进行Elastin染色和超薄部分的增强。 Med电子Microsc 36:3(2003)179-182。
  11. Rumper W,Seale J,Clevidence B,Judd J,Wiley E,Yamamoto S,Komatsu T,Sawaki T,Ishikura Y,Hosoda K:乌龙茶增加了代谢率和脂肪氧化,在:MEN J NUTR 131(2001)2848- 2852。
  12. Yamaguchi K,Suzuki K,Tanaka K:电子污渍作为细菌细胞超薄部分的乙酸铀蛋白替代品。电子显微镜(东京)59:2(2010)113-118。

附注证明:对替代乙酸铀酰的读者也称为 Nakakoshi M,Nishioka H和Katayama E.用于生物透射电子显微镜的新多功能染色试剂,替代乙酸铀酰酯。电子显微镜杂志60:6(2011)401-407。

有兴趣了解更多吗?

Talk to our experts. 我们很乐意回答所有问题和疑虑。

联系我们

你更喜欢个人咨询吗?

  • 徕卡 Microsystems Inc.
    1700 Leider Lane.
    布法罗格罗夫, IL 60089. 美国
    Office Phone : +1 800 248 0123
    Service Phone : 1 800 248 0223
    Fax : +1 847-236-3009

您将在此处找到更详细的本地联系人列表。