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出色的GSDIM超分辨率图像实用指南

如何使用Leica SR GSD 3D定位显微镜可视化细胞细节

您是否知道大多数生物和细菌缺乏我们每个人体细胞所具有的功能?我们的细胞 彼此接触和交流。它们发送和接收各种信号,这些信号协调其行为以共同发挥功能性多细胞生物的作用。探索细胞通信的方式以及细胞表面如何相互作用以组织组织和身体结构的方式引起了极大的兴趣。

组织的总体结构由粘附机制决定,该粘附机制涉及由细胞骨架结构,桥粒和半桥粒形成的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。细胞骨架存在于所有细胞中,形成一个相互连接的细丝和细管的动态网络,这些细丝和细管延伸穿过细胞质,赋予细胞特殊的形状和​​张力,并维持囊泡蛋白和信号级联的细胞内转运。了解细胞相互作用的结构组织非常重要,因为这些连接中的缺陷与多种疾病有关。

在阿姆斯特丹的帮助下,基斯·贾林克(Kees Jalink)和他在阿姆斯特丹的荷兰癌症研究所(NKI)的科学家团队获得了关于半线粒体,细胞骨架成分,细胞表面受体和囊泡蛋白的分子结构的新科学见解。 基态损耗(GSD)/ 暴风雨 显微镜检查。

在随后的采访中,Kees Jalink评论了它们在成像室,缓冲条件和图像分析方面的发展,以获得完美的超分辨率图像。

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您的主要研究主题是什么?为什么使用Leica SR GSD 3D超分辨率显微镜?

基斯:我一直对使一批死化学物质“活着”的原因感兴趣,换句话说,就是细胞如何工作。生命在于分子的数量和类型,分子的详细定位及其相互作用。

即使使用理想的显微镜也无法看到大多数分子。它们没有颜色并且太小。在过去的几年中,在分子着色方面取得了巨大的进步:我们拥有各种颜色的荧光蛋白来标记蛋白质,我们拥有用于对DNA特定部分进行染色的探针,并且我们的传感器能​​够看到小分子信使,例如钙2+ 还有很多。有了这些,活细胞成像使我们能够在时间和空间上追踪这些不可见的分子。但是,仅就光学显微镜的分辨率而言,其分辨率比我们看到分子所需的分辨率低约100倍。

功能成像技术 喜欢 荧光共振能量转移(FRET), 光漂白后的荧光恢复(FRAP)荧光寿命成像(FLIM) 让我们看到分子间的相互作用。但是同样,只有0.25 µm的分辨率,并且实验是劳动密集型的。而且还必须意识到,即使两个分子相互作用,此类实验的结果也可能是负面的。

GSD和超分辨率是获得足够的分辨率来研究分子及其相互作用的逻辑下一步步骤(图1)。

使GSD技术适应您的要求需要克服哪些障碍?您是如何解决问题的?

基斯: 当我们开始时,开箱即用 徕卡SR GSD 3D定位显微镜 工作正常。这是单色超分辨率的时代,主要是 蒂尔夫 (全内反射荧光)模式。

我们曾预料到需要进行染料眨眼的优化,而实际上这是第一步。多数染料闪烁不充分,而那样的染料通常不会相互结合。我们对缓冲液进行了广泛的优化,发现某些组合可以同时用于两色和三色成像。我们开发的缓冲系统称为OxEA,在我们发布该缓冲系统之前,该缓冲系统已经在全球许多同事的实验室中进行了测试(图2)。 [1]

甚至大约20.000帧左右后,甚至像AlexaFluor®647这样的非常好的染料也最终耗尽了。我们实验室的Leila Nahidiazar发现,如果您非常小心,可以借助特殊设计的氧气密闭室(OTC)将氧气完全隔离开。在这些条件下,很容易从单个单元获取数十万张图像。这对于缝合特别重要。仍然有许多我们不了解的事情。您是否知道肌动蛋白染料鬼笔环肽与AlexaFluor®647结合使用时,如果用强激光照射,会失去对肌动蛋白的亲和力?其他颜色都可以!

我们还在3D成像上投入了很多时间。 徕卡SR GSD 3D系统本身具有切片特性,因此可以组合不同的焦平面(通常在影片1的氧气密闭腔室的帮助下)。我们是第一个测试用于3D成像的Leica散光透镜解决方案的人(电影2)。并且似乎可以合并多个散光透镜图像,以达到约50 nm分辨率的扩展3D堆栈。

最后,我们开始在组织切片中进行GSD成像。当然,结果并不像盖玻片上的细胞那样清晰,但是在两色图像中分辨率得到了明显的改善,这些都有助于验证我们在体外观察到的结构在组织切片中也是可辨别的。

电影1:波形蛋白细丝的扩展3D图像,通过将焦点逐步穿过细胞而构建。没有使用柱面透镜。轴向分辨率约为500纳米图片:基斯·贾林克(Kees Jalink)/ 莱拉·纳希迪亚萨(Leila Nahidiazar),NKI阿姆斯特丹。

电影2:使用像散透镜获取的单个焦平面(厚度为800 nm)的详细3D图像。轴向分辨率约为50 nm。图片:基斯·贾林克(Kees Jalink)/ 莱拉·纳希迪亚萨(Leila Nahidiazar),NKI阿姆斯特丹。

您如何分析获取的数据?您如何看待初始实验的图像质量?你有适应吗?您创建了任何特殊的分析工具吗?

基斯: 当我们开始使用 徕卡SR GSD定位显微镜 我们使用不同的市售培养皿和安装程序广泛研究了样品漂移。通过分析从具有亚分辨率荧光珠(Invitrogen)的盖玻片上获得的长时间成像序列,Chamlide CMB磁室(Live Cell Instrument,韩国首尔)被发现具有最小的漂移。另外,我们在成像前20分钟将样品放在显微镜平台上,以使样品沉降。如果x / y漂移很明显,我们将使用自制的“去抖动”例程或分析软件包ThunderSTORM对此进行校正。

我们发现,在图像获取期间,可以在这些已经令人印象深刻的图像中引入伪像,尤其是在背景非常高的情况下。现有的背景减法只能部分解决该问题。因此,我们与阿姆斯特丹大学(UvA)的Eelco Hoogendoorn和Marten Postma合作,他们实施了一种新的背景扣除方法:运行时间平均的中值滤波器(图3)。这很好。 [2]

然后我们发现,在如此高的放大倍率下,在衍射极限世界中未被注意到的小图像误差将不再被忽略。正如我们实验室中的丹妮拉·莱顿(Daniela Leyton)所显示的那样,色差非常明显,他正在研究一种蛋白质,该蛋白质在刺激细胞后会转移到质膜上。问题是它是否易位至质膜脂质双层,或仅与邻近的皮质肌动蛋白结合,这个问题似乎适合于超分辨率。

最初,Daniela发现Clic4几乎总是紧邻脂质双层,但根据细胞的方向,它们有时出现在细胞中,有时出现在细胞外。怀疑是色差的起因,与物理学家布拉姆·范·登·布雷克(Bram van den Broek)一起,在红色,绿色和蓝色通道中对嵌入基质中的0.1 µm Tetraspec微球进行了成像。利用这些数据,我们可以量化色差,并能够使用自制的Image J宏使用仿射变换矩阵对其进行精确校正(图4)。 [3]

请记住,色差取决于所使用的物镜,必须单独进行校正,但是一旦确定了特征,则校准将在整个年份中一直有效。

Daniela还花了很多时间来比较超分辨率显微镜的固定方案。固定伪影的发生以及如何处理这些伪影在电子显微镜中已得到充分记录。但是,这些协议不能简单地复制用于SR成像,因为制剂通常在水性缓冲液中成像。

对于肌动蛋白细胞骨架和相关肌动蛋白结合蛋白的组合成像,Leyton-Puig等人的方案获得了最佳结果。等,2016年。 [4]

GSD为您的研究提供了哪些新见解?这如何改变了您对研究领域的理解?

基斯: 许多!太多了,不能一一列举。例如,我们观察到半纤体的分子结构(确保您的皮肤不会脱落的粘附结构)并不完全是因为它们被认为是基于早期的电子显微镜和宽视野荧光显微镜。

我们发现,DNA片段可能进入核膜内小叶的层状网络中的空白空间(某种口袋)。我们正在研究细胞骨架成分,细胞表面受体和囊泡蛋白,所有这些都带来了新的科学见解和新的科学问题。令人吃惊的观察结果是,中间的细丝网络似乎与微管紧密相关,并且主要在细胞外围观察到。该技术是如此强大,以至于我们不断收到想要合作的团体的请求。

另一个重要的见解是,迫切需要定量图像分析-而且比以前更容易实现。分辨率远胜于荧光显微镜,标记密度远胜于荧光显微镜 电磁,我们可以开始计算簇中受体的数量,以量化细丝和锚定它们的蛋白质之间的距离,可以定量两种不同分子种类的空间分离,甚至更多。但是传统的工具(例如Manders系数或Pearson相关系数)不再适用!根据定义,单分子定位不会重叠,因此我们不得不问一个问题:两种分子的平均距离是多少?这需要新的分析工具。 [5,6,7,8,9]

您目前使用GSD技术进行哪些项目?您认为使用诸如sCMOS之类的新相机技术有什么可能性?

基斯: 新的 sCMOS相机 在我们手中有几个优点。它在〜500 Hz时提供(几乎)相同的图像质量,即比大约5倍快 CCD。相机可以达到1500Hz,但在这种情况下,我们收集的光子不足以获取最高质量的图像。

快5倍意味着在缓冲区用尽之前的实验要多5倍,漂移要少得多,漂白要少得多。在低功耗模式(40 x 40 µm视场)下,它也表现出色。

但是最令人兴奋的是,我们开始在活细胞中进行GSD。我们很早就发现,当用488 nm激光激发时,mVenus会闪烁得很好。

不要指望达到5 nm的定位精度,但可以肯定的是20-30 nm是可以达到的。我们现在也开始通过对仍在开发中的某些红色荧光蛋白(FP)突变体进行成像来进行2色活细胞成像。我们在mEOS上也取得了不错的成绩。

注意,激发强度如此之高,以至于细胞可能在几分钟之内被损坏。然而,对于解决快速事件(如开通和关断微管高速公路的囊泡),这具有巨大的潜力。

我们目前的研究方向集中在各种细胞生物学问题上,包括刺激后受体的内在化,福明斯对肌动蛋白细胞骨架的调控以及基因组与核层板之间的相互作用。我们还继续研究细胞粘附结构和中间丝:还有很多发现。

您能否描述GSD实验的典型工作流程?

基斯: 细胞生长并在1.5H盖玻片上染色,然后放置在低漂移Chamlide CMB磁室中。为了优化两色和三色超分辨率图像的闪烁,样品中装有500 µL的氧化酶缓冲液(OxEA)。在获取图像之前30分钟将样品放置在显微镜载物台上,以避免初始样品移动。

在为每种颜色收集10 – 50k帧后,我们将原始背景中值进行时间中值校正,并将我们自己构建的软件漂移校正值应用于原始数据。最后,使用Image J插件ThunderSTORM渲染图像,并使用自制的Image J宏对色差进行校正。

电影3:BP180(红色)和角蛋白14(绿色)的超分辨率图像。图片:基斯·贾林克(Kees Jalink)/ 莱拉·纳希迪亚萨(Leila Nahidiazar),NKI阿姆斯特丹。

References

  1. 为苛刻的多色超分辨率定位显微镜优化成像条件,Nahidiazar L,Agronskaia AV,Broertjes J,van den Broek B,Jalink K,PLoS One(2016),11(7),dx.doi.org/10.1371/journal .pone.0158884
  2. 随机单分子超分辨率重建的保真度主要取决于可靠的背景估计,Hoogendoorn E,Crosby KC,Leyton-Puig D,Breedijk RM,Jalink K,Gadella TW,Postma M,Sci Rep.2014 Jan 24; 4: 3854。 doi:10.1038 / srep03854
  3. CLIC4调节细胞粘附和β1整联蛋白运输,Elisabetta Argenzio等人,J Cell Sci(2015)127,5189-5203。 doi:10.1242 / jcs.150623
  4. PFA固定可实现肌动蛋白细胞骨架和相关蛋白,Leyton-Puig D,Kedziora KM,Isogai T,van den Broek B,Jalink K,Innocenti M.Biol Open的无伪像超分辨率成像。 (2016),doi:10.1242 / bio.019570
  5. 半分辨小体的分子结构,如超分辨率显微镜所揭示,Leila Nahidiazar等人,Journal of Cell Science(2015)128,3714-3719。 doi:10.1242 / jcs.171892
  6. Jop Kind等人在单个人细胞中核层互动的全基因组图。 Cell(2015)163(1),134-147。 doi:10.1016 / j.cell.2015.08.040
  7. 杆结构域对于凝集素在维持组织完整性中的功能不是必需的,Mirjam Ketema等人,Mol Biol Cell(2015)26(13),2402-2417。 doi:10.1091 / mbc.E15-01-0043
  8. 共同取向:在光学显微镜中量化细丝的同时共同定位和取向,Robert P.J.Nieuwenhuizen和Leila Nahidiazar等人,《公共科学与工程》(2015),10(7)。 doi:10.1371 / journal.pone.0131756
  9. 胆固醇和ORP1L介导的ER接触位点控制自噬体的运输和与内吞途径的融合,Ruud H.Wijdeven,Hans Janssen,Leila Nahidiazar,Kees Jalink,Ilana Berlin,Jacques Neefjes,Nature Communications(2016),11808. doi:10.1038 / ncomms11808