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高端共聚焦显微镜中集成了视频速率的精确,快如闪电的光谱荧光江苏体彩成像

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Förster(荧光)共振能量转移( 烦恼 )已成为研究活细胞中蛋白质相互作用和信号转导的强大工具。 烦恼 通常通过检测供体和受体强度之比(敏化发射)或通过检测供体的激发态江苏体彩(随江苏体彩的增加而降低)来读出 烦恼 (荧光江苏体彩成像或 电影 )。 电影 具有很强的抗漂白能力和固有的定量性。在共聚焦显微镜上 电影 通常由时间相关的单光子计数(TCSPC)读出。这需要昂贵的附加硬件,并且固有的速度非常慢,因此必须累积许多连续扫描才能获得低噪声的使用江苏体彩图像。因此,生命周期会快速变化,例如在读取活细胞信令事件时遇到的变化 烦恼 传感器,无法检测到。图像的积累和/或非常慢的扫描也会在所获取的图像中引起形态伪像。

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Key Learnings

我们提出 SP8猎鹰 来自Leica Microsystems的新型高端共聚焦仪器,内置速度非常快 电影 能力。该仪器采用一种新颖的技术,使用内置的光谱HyD检测器记录高达80 MHz(如果使用两个检测器,则为160 MHz)的光子到达时间。为了达到如此高的计数率,该仪器使用了实时10 GHz采样和分析算法,从而使其在很大程度上不受脉冲堆积的影响。鹘 电影 已完全整合到 LAS -X软件,可以方便地获取 电影 延时,缝合 电影 概述图像, 电影 XYZ堆栈和光谱 电影 堆栈,及其组合。

我们仔细检查了SP8 FALCON的性能,并将其用于记录激动剂引起的第二信使(例如cAMP和Ca2 +)浓度的变化,并且亚微米级的速度较高,速度约为每秒几帧(512×512)( FPS)。通过以下方式检测cAMP 电影 ,我们使用了最新一代的基于EPAC的专用 电影 传感器,使用mTurquoise2作为供体,并串联两个黑色深色维纳斯单体蛋白质作为受体。将图像格式减少到128×128像素,我们获得了良好的质量 电影 25 FPS(使用共振扫描为83 FPS)时延,甚至可以检测到非常快速的信号事件,包括G蛋白和Ca2 +火花的激活。大量检测到的光子减少了计算江苏体彩中像素间的差异。最后,我们证明SP8-FALCON非常适合快速 电影 筛选固定和活细胞格式的应用程序。

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