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Ratiometric Imaging

通过测量荧光团位移分析离子浓度

细胞的许多基本功能在很大程度上取决于细胞胞质溶胶与周围细胞外空间之间离子(例如钙,镁),电压电势和pH的微妙但动态平衡。这些平衡的变化会极大地改变细胞的行为和功能。因此,对于神经科学,细胞生物学和细胞生理学的研究人员而言,实时测量细胞内离子,电压和pH的动态变化引起了极大的兴趣。然而,在许多情况下,使用常规的荧光方法很难准确估计实际离子浓度或细胞或细胞网络中不同位置的相对变化。原因是这些方法没有考虑到单个细胞的不同部分内或细胞网络中细胞类型之间的细胞形态差异可能会影响发射光的质量和数量这一事实。当研究离子浓度,电压或pH的动态变化时,这可能导致严重的误解。比例成像技术通过观察荧光团的发射波长偏移或通过比较荧光团组合的发射强度而不是仅测量强度变化来绕过这些问题。

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通过测量荧光团发射位移估算离子浓度和pH或电压变化

研究活动越来越侧重于识别和识别时空分布。局部“热点”,用于动态改变细胞或细胞网络中离子浓度,电压或pH值。这样的“热点”通常位于蜂窝网络中某个小区的特定部分或某些小区中。此外,就细胞代谢或结构而言,这些区域与标本的其余部分相比通常具有不同的特性。用于研究动态生理状态的常规荧光团会在离子结合,pH改变或电压改变时改变其发射强度(例如,fluo-4在钙结合时会增加发射)。但是,这些标记未考虑结构,直径或标记吸收/表达的差异会导致发射光量的变化,而该变化与实际离子浓度,电压或pH不相关。为了定量比较地检测细胞结构或不同细胞的变化,需要一种对结构直径和荧光团浓度不敏感的方法。与非比例成像方法相比,比例成像提供了可重复性地测量绝对细胞内离子,电压和pH值/相对于细胞直径,荧光团浓度和成像设置的光学特性的变化的机会。但是,比率成像取决于激发波长或检测到的波长的快速变化,强光源,光学组件的出色透射和快速的信号检测。超快速滤轮的最新发展, 紫外线光优化的物镜,高灵敏度的荧光团和新型 CCD 摄像头允许以高空间分辨率负担得起的定量高速活细胞成像。

双波长激发/检测是测量荧光团发射位移的关键

如上所述,在比例成像中,成像了发射位移而不是仅仅强度变化。为了测量发射位移,必须通过使用两个不同的激发波长或通过在两个不同的发射波长下进行检测来测量荧光团或荧光团组合的强度变化。对于常用的钙成像染料fura-2,该染料必须被波长为340的光激发 nm and 380 nm,检测波长为510 纳米与此相反,钙成像染料indo-1通常在350的光下激发 nm波长,检测波长为405 nm and 485 纳米(请参见比率成像的典型应用中的图1)。

图1:使用比例钙指示剂Fura-2进行钙成像实验后的快照。描绘了在340 nm(左)和380 nm(中)激发之后的假彩色图像和相应的计算出的比率图像(右)。该图像系列显示了三个时间点:在第一个时间点(1),未刺激细胞,并且细胞内钙处于静止水平。在第二个时间点(2),细胞受到刺激,钙含量达到最高水平。在第三时间点(3),细胞内钙水平正在下降。在图表中标记了相应的时间点。上面的图显示了340 nm图像的强度,中间的图显示了380 nm图像的强度,下面的图显示了比率强度。

但是为什么需要双重激发或发射检测?为什么不简单地测量荧光强度的变化?

在使用荧光团检测离子水平,电压或pH值变化的实验中,发出的荧光强度取决于几种特性。这些在以下等式中描述:

F =荧光强度; c =荧光团浓度; d =样品直径(z轴); K =光路中组件的光学常数(像元特性,物镜,滤光片等); f(x)描述了给定荧光团的发射行为,例如离子束缚或发生电压/ pH变化。

该方程式表明,光强度在很大程度上取决于光路中的荧光团数量。光路上的荧光团数量取决于细胞中荧光团的实际浓度(c)(由标记物的摄取或表达决定)和成像样本的直径(d)。这使得仅通过简单地观察荧光强度,例如pH值,难以直接估计所研究的离子的浓度,pH水平或电压变化。不能说:“强度100等于细胞中的游离钙100 nM”。样品直径(d),荧光团浓度(c)以及样品和装置的光学特性(K)几乎无法测量,但会显着影响检测到的总强度。另外,必须牢记,上面显示的公式对于样品中的任何给定点都是正确的。由于直径(d)和荧光团浓度(c)在整个样本中甚至在一个单元内均不均匀,因此对于样本采集图像中的每个像素,c和d的值可能会有所不同。如果例如在样品的“ A”点,细胞的直径很大,而游离钙则很低,光强度可能与“ B”点的光强度相同,相反。然而,由于检测到的荧光强度相似,实验者可能会错误地得出结论,两个地方的钙浓度相似。

图2:上面的草图旨在说明如果例如以下情况可能发生的误解。细胞内的钙浓度由非比例钙敏感荧光团的发射光强度来判断。草图下方的曲线表示单元不同部分中感兴趣区域(ROI)中的光强度。
在上图(A)中,细胞在不同的区室中具有不同的厚度(公式中的d),例如通常为精细结构(例如神经元的树突和轴突)的细胞突起。由于光路中的所有荧光团都被激发光激发,并且收集了它们发出的光,因此,较厚的部分比较薄的部分要亮得多。这可以得出这样的假设:尽管实际钙浓度相同,但电池较厚部分的钙浓度高于相对较薄部分的钙浓度。
在下图(B)中,显示了不同的情况。在某些细胞类型中,细胞区室之间的荧光团吸收可能不同。在下面的示意图中,电池较厚部分的钙浓度(公式中的c)较高,但该区域的荧光团浓度较低。由于检测到的钙敏感染料的荧光强度不仅取决于细胞中的钙浓度,还取决于荧光团浓度,因此可能会给人一种印象,即整个细胞中的钙浓度是相同的。

为了克服这些问题并精确测量绝对离子浓度,pH值或电压,已经开发了比例成像。所有比率测量方法的共同点是,对发射光的强度进行两次测量,然后计算这些强度的比率(R)。根据所使用的荧光团或荧光团的组合,使用两种不同波长的光激发荧光团,并在一个波长下测量发射强度–或使用一种波长的光激发荧光团或荧光团,并在以下波长下测量发射量两种不同的波长。这仅意味着获取两个灰度值图像并从它们中计算出比率图像。两个灰度值图像的强度通常不同,但是图像中每个像素的强度可以通过以下公式描述:

F =荧光强度; c =荧光团浓度; d =样品直径(z轴); K =光路中组件的光学常数(像元特性,物镜,滤光片等); f(x)描述了给定荧光团的发射行为,例如离子束缚或发生电压/ pH变化。

如名称比率成像所暗示的,计算两个同时获取的图像的每个像素的比率值。例如,如果使用非常常用的钙敏感染料Fura-2(在340和380 nm处激发),则得出的方程式为:

根据简单的数学,可以取消c,d和K,并且该比率可以描述为:

根据简单的数学,可以取消c,d和K,并且该比率可以描述为:

虚拟比率图像由两个灰度值图像计算得出

实际上,该比率是由计算机计算的,在延时实验中,许多情况下都是在线计算的。通过计算两个独立获取的灰度值图像的对应像素的灰度值的比率,来创建比率图像。请记住,灰度值图像基本上是灰度值矩阵,具有摄像机分辨率或感兴趣区域(ROI)的大小(通常为512x512,最大为1,000 x 1,000 像素)。在使用染料Fura-2的钙成像延时实验中(激发:340 nm and 380 nm, emission: 510 nm),如下所示(假设图像的大小为3 x 3 pixels):

图3:强度读数的简化图示 CCD 使用钙探针fura-2的钙成像实验中,热像仪可能会传送到计算机。在这种情况下,图像大小为3 x 3像素。上面三个矩阵代表在340 nm和380 nm激发下钙静置浓度下的强度读数值以及相应的比率值。
较低的三个矩阵表示突出显示的像素中钙浓度升高时强度值的变化。 340 nm激发的值增加,而380 nm激发的值减少。但是,相应的比率值也会增加。

在延时实验中,对每个图像对的每个像素执行此操作,从而创建比率图像堆栈。最后,可以将伪彩色图应用于比率图像堆栈,然后可以像正常的灰度值定时影片一样观看和量化该堆栈。

除了上述优点之外,比率的计算还具有其他优点。当使用离子,电压或pH敏感的荧光团进行活细胞成像时,通常会在相应波长发生荧光强度的微小变化。但是,在比率成像中,在大多数情况下(无论探针是被激发还是被两个波长检测),在一个波长处的强度都会增加,而在另一波长处的强度会降低。如果随后计算两个获取的图像的比率,则与仅荧光团的强度变化相比,基线和信号幅度之间的差异将得到增强。因此,比率成像会放大检测到的信号的幅度。这对于 烦恼 在能量转移过程中,受体蛋白的荧光强度降低而受体蛋白的荧光强度升高。

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比例成像Needs a Specialized Setup