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嗜中性白细胞募集到细菌感染的实时观察

以斑马鱼幼虫为模型生物的荧光显微镜研究

斑马鱼(里约热内卢)是一种新兴的脊椎动物模型生物,可用于研究感染。透明的幼虫包括一个功能齐全的先天免疫系统,能够对转基因动物中的荧光免疫细胞进行实时成像。已经针对两种人类细菌病原体开发了斑马鱼感染模型 弗氏志贺氏菌 和天然鱼类细菌病原体 海水分枝杆菌。重要的是 弗氏链球菌 引起急性感染,通常用作炎症范例, 海藻 引起类似于人类结核病的慢性疾病。在这里,我们使用实时荧光显微镜对表达绿色荧光蛋白eGFP的嗜中性粒细胞(粒细胞白细胞)的转基因斑马鱼幼虫进行成像。这种方法可以比较中性粒细胞募集 弗氏链球菌 海藻。在3天大的斑马鱼幼虫的后脑心室(HBV)中使用低剂量感染,我们显示出嗜中性粒细胞的强大而显着的募集 弗氏链球菌。相比之下,我们没有看到类似剂量的嗜中性白细胞大量募集 海藻。这些数据与以前的研究一致,表明 弗氏链球菌 诱导中性粒细胞募集的组织炎症和趋化线索,而 海藻 在很大程度上避免了中性粒细胞的募集。这项比较研究突出了斑马鱼幼虫对研究宿主与病原体相互作用的价值 体内.

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Introduction

弗氏链球菌 是人类适应的 大肠杆菌 具有入侵结肠粘膜(大肠膜衬里)的能力的细菌,会引起炎症和细菌性痢疾。已经对该病原体的细胞内生活方式进行了深入研究 体外志贺氏菌 最近已被认可为研究宿主先天免疫的一种炎症范例。但是,由于缺乏自然志贺菌病的小鼠模型, 体内 研究 志贺氏菌 发病机制(引起疾病的机制)受到限制 [1].

海藻 是一种天然鱼类病原体,会在宿主组织中导致肉芽肿性坏死病变(炎症引起的组织损伤)。这些病变在组织学上类似于由 结核分枝杆菌,是人类结核病(TB)的病原体。再次,缺少可以完全概括这种疾病的小鼠模型,以及与研究相关的对人类健康的风险 结核分枝杆菌,难以有效地研究结核病 体内。为此, 海藻-斑马鱼感染模型已成为了解分枝杆菌感染的核心机制的极有价值的替代品 [2, 3].

非哺乳动物模型对于理解多种疾病(感染,癌症,神经退行性疾病)以及开发可改善人类健康的疗法具有重要意义。尤其是,斑马鱼是一种脊椎动物模型,与人的遗传,发育和生理上都表现出明显的相似性 [4]。斑马鱼高度繁殖力,外部受精,生命周期短。从实用的角度来看,这些特征意味着大量且容易获得一致的胚胎可供研究。此外,斑马鱼的幼虫阶段自然是半透明的,提供了独特的可视化和解剖机会 体内 荧光细胞在转基因幼虫中的行为。特别是,感染模型可受益于带有荧光标记免疫细胞的斑马鱼品系,从而使 体内 白细胞(白细胞:巨噬细胞,嗜中性粒细胞)的成像及其在炎症和传染病中的作用。

在这里,我们使用 弗氏链球菌 海藻 斑马鱼感染模型研究嗜中性白细胞招募感染 体内。转基因幼虫感染期间荧光标记细菌的实时成像显示高度病原体特异性中性粒细胞募集。令人惊讶的是,尽管我们观察到中性粒细胞快速而稳健的募集 弗氏链球菌 感染,类似剂量 海藻 不会刺激嗜中性粒细胞大量迁移到感染部位。这些数据突出了实时成像的价值,以使您能够了解宿主对细菌感染的反应。

Methods

斑马鱼的保养与维护

在自由饲喂阶段之前,所有实验均在受精后(dpf)少于5天的斑马鱼幼虫上进行。因此,此处报道的所有实验均不属于英国和欧盟的动物实验法规。根据欧盟关于处理实验动物的准则和1986年《帝国理工学院伦敦动物(科学程序)法》,对成年繁殖鱼进行了维护。所有实验和程序均得到了内政部的批准(项目许可:PPL 70/7446)。如前所述,通过自然产卵获得鸡蛋,将其清洗并保存在含有0.5X E2胚胎培养基的陪替氏培养皿中,该培养基中添加了0.3 mg / ml亚甲蓝。为了进行显微镜检查,在受精后24小时(hpf)向胚培养基中补充0.003%的1-苯基-2-硫脲,以防止黑色素的合成。图1显示了伦敦帝国学院的斑马鱼存放设施。

图1:帝国理工学院设施中的S. Mostowy(左)和A. Willis(右),那里养有成年斑马鱼。幼虫在该设施中的类似鱼缸中繁殖,该鱼缸中装有繁殖船。

细菌制剂

本研究中使用的细菌菌株为:

1)  Wild-type (wt) 弗氏链球菌 (M90T株)表达mCherry(红色荧光蛋白);

2)  Wt 海藻 (M株)表达mCherry [5].

对于显微注射的斑马鱼幼虫,通过离心收集细菌,洗涤并以所需浓度(〜500 CFU / nl)重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

斑马鱼幼虫的细菌感染

对于注射程序,将幼虫用200 mg / ml的三卡因麻醉。在3 dpf的剂量下,将放置在琼脂糖注射板上的幼虫用1 nl(〜500 CFU)的任一种显微注射到后脑室(HBV)中 弗氏链球菌 要么 海藻 细菌悬浮液 或干净的PBS溶液作为对照。使用IM 300微型注射器(Narishige)和 M80 如前所述的立体显微镜(Leica Microsystems) [6]。接种物被确认 后验 通过注入一滴PBS和细菌接种。图2a-b显示了用于细菌和幼虫准备以及显微注射的实验室设备。

图2a:CMBI,ICL实验室,显示了用于显微注射细菌的制备斑马鱼幼虫的设备。

图2b:A. Willis说明了用于显微注射的弗氏链球菌细菌和斑马鱼幼虫的制备方法。

斑马鱼幼虫的实时成像

斑马鱼HBV非常适合成像,并且可以随着时间的推移跟踪注入的病原细菌和白细胞。为了进行嗜中性粒细胞募集到注射部位的体内成像,将麻醉的斑马鱼幼虫定向并固定在1%低熔点琼脂糖中,并用含Tricaine的0.5X E2培养基覆盖。明场和荧光宽场成像使用 M205 FA 荧光体视显微镜(Leica Microsystems)。以15分钟的间隔获取多场z堆栈(多焦点成像)。自动化阶段允许同时追踪几只动物(3只PBS注射的对照幼虫,4只海藻支原体感染的幼虫和5支弗氏链球菌感染的幼虫)。图3a-c显示了两位共同撰写幼虫图像的作者。

图3a:V. Torraca证实在显微注射mCherry荧光后在活的,麻醉的斑马鱼幼虫中感染 海藻 在乙肝病毒中。成像使用 M205 FA 体视显微镜。

图3b:A.威利斯显微注射mCherry荧光后对活的麻醉的斑马鱼幼虫进行成像 弗氏链球菌 在乙肝病毒中。成像是通过 M205 FA 体视显微镜。

图3c。使用M205 FA立体显微镜在明场和荧光模式下对感染的麻醉的斑马鱼幼虫进行实时成像。

中性粒细胞定量

使用先前发表的Tg(mpx:eGFP)转基因斑马鱼品系进行定量,中性粒细胞表达增强的绿色荧光蛋白eGFP [7]。通过荧光立体显微镜拍摄的图像被处理成电影并使用ImageJ软件进行分析 [8]。在感染后(hpi)1和6小时,在后脑中对募集的表达eGFP的中性粒细胞进行定量。统计数据是使用学生t检验通过Graph pad棱镜计算得出的。

结果与讨论

中性粒细胞是高度运动的先天免疫细胞,通常对入侵的病原体快速反应。因此,嗜中性粒细胞募集,吞噬作用和病原体破坏对于最初控制许多感染非常重要。我们在这里显示,斑马鱼幼虫中性粒细胞对 弗氏链球菌。相反, 海藻 很大程度上避免了中性粒细胞的检测(图4a-b)。量化显示 弗氏链球菌 注射的鱼后脑室中性粒细胞数量增加了2.7倍 相对于对照鱼(仅PBS)已经增加了1 hpi,在6 hpi时增加了3.0倍(图5)。相比之下,中性粒细胞定位于 海藻 在测试的任何一个时间点(1或6 hpi),后脑心室的感染与对照幼虫均无显着差异。

这些观察结果与以前的研究相一致,已经表明 弗氏链球菌 乙肝病毒感染可触发各种炎症介质的激活并诱导趋化性线索,从而积极招募中性粒细胞 [9,10]。另一方面,研究使用 海藻 HBV感染已证明趋化提示可忽略不计 [11]。数据表明,嗜中性粒细胞仅在感染的晚期,更晚期和炎性阶段即在组织中形成肉芽肿(聚集巨噬细胞发炎)时才与分枝杆菌相互作用。 [11]。在这种情况下,嗜中性粒细胞被无法控制的垂死感染巨噬细胞所吸引的碎片吸引 海藻 感染。

沙门氏菌的不同炎症和化学吸引特性 S.弗氏菌海藻 演示宿主-病原体相互作用的“微调” 体内. 志贺氏菌 肠杆菌是一种肠细菌,依靠肠上皮衬里的炎性破坏来侵入,存活并在其宿主内复制。炎症由病原体分泌的毒力因子介导。侵入肠上皮后,宿主进行转录重编程以产生趋化因子,例如强嗜中性白细胞引诱剂白细胞介素8(IL-8) [12]。尽管中性粒细胞对于杀死细菌很重要,但它们也可以破坏肠道上皮并促进无法控制的细胞的侵袭增加 志贺氏菌.

相反, 海藻 (如同 结核分枝杆菌)优先建立慢性感染。细菌掩盖了表面脂质层下方的病原体相关分子模式(PAMP),以逃避先天免疫识别的早期阶段 [13]。众所周知,分枝杆菌可以利用复杂的机制(例如诱导Ccl2和Cxcl11)在巨噬细胞内建立适当位置,以特异性地吸引巨噬细胞 [13,14]。在巨噬细胞领域, 海藻 可以复制并随后在主机中传播。传播的细菌形成肉芽肿性病变,是分枝杆菌感染的标志,可作为细菌保护屏障并减少免疫细胞的进入 [15].

图4a:弗氏链球菌感染引起的中性粒细胞募集:将3天大的带有绿色中性粒细胞的Tg(mpx:eGFP)幼虫注入约500 CFU mCherry-S HBV中。 Flexneri。将麻醉的幼虫固定在琼脂糖中,并使用M205 FA荧光体视显微镜每15分钟成像9小时。使用ImageJ处理帧以产生电影。单位“ mpi”是指注射后的分钟数。

图4b:缺乏由M. marinum感染引起的嗜中性白细胞募集:将具有绿色中性白细胞的3日龄Tg(mpx:eGFP)幼虫注入约500 CFU mCherry-M的HBV中。腌料将麻醉的幼虫固定在琼脂糖中,并使用M205 FA荧光体视显微镜每15分钟成像9小时。使用ImageJ处理帧以产生电影。单位“ mpi”是指注射后的分钟数。

Conclusions

斑马鱼是一种新兴的模式生物,用于研究 志贺氏菌 和分枝杆菌感染,对我们对细菌如何导致疾病的理解做出了重要贡献 体内。利用斑马鱼幼虫的感染,细菌和宿主细胞之间的相互作用可以高分辨率成像。在这里,我们利用透明斑马鱼幼虫的光学可及性来研究 弗氏链球菌 海藻 中性粒细胞(粒细胞白细胞)。这些观察结果可以帮助我们更好地了解宿主对重要细菌病原体的防御,并阐明控制人类细菌感染的新方法。

References

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