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解析字段编号(RFN)

共焦成像的性能指标

光学显微镜的视场编号(FN)表示视场(FOV)。它对应于中间图像中通过目镜可观察到的区域。尽管我们无法一次观察非常大的视野,但是人眼可以扫描并整合整个视野的结构特征。此外,至关重要的是,场大小和分辨率必须适合人眼的能力。

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相机具有固定的观察场,无法扫描显微镜光学系统的整个FOV。因此,必须减小视场(通过插入其他光学组件),以便可以将图像投影到相机传感器上而不会造成损失。

在扫描显微镜中,像真正的共聚焦激光扫描仪一样,FN表示可以扫描样品的最大区域,但是实际扫描过程必须设置正确的参数,否则可能会丢失分辨率。这种情况通常意味着应观察到较小的视野或使用非常大的图像格式。为了能够比较这些限制,引入了修改的字段号(RFN)。 RFN是指最大解析字段。

Field Number (FN)

显微镜中的视场数(FN)定义为可通过目镜观察到的中间像平面中区域的直径。例如20mm的视场数表示物镜放大后的观察样品区域被限制为20mm的直径。如果物镜具有20倍FN的40倍放大倍率,则可以观察到直径为500 µm的样品区域。

与d领域 是观察样品区域的直径,而Mag是物镜的放大倍数。

通常,将放大倍数刻在镜筒上,将视场编号刻在目镜筒上。有了这些信息,您始终可以计算出当前正在观察的FOV的直径:

对于宽视场显微镜,FN由目镜中金属膜片的直径设置。设置其大小以确保在观察到的视野内具有良好的图像质量,因为所有光学系统都会导致距镜头中心远的光学像差增加。然而,“高质量”的定义仅针对场的平坦度(1)进行了标准化,为讨论其他像差留有余地。

Confocal scanning

在共聚焦扫描显微镜中,实际上不会产生这样的中间图像。实际上,针孔位于中间图像平面中。通过针孔的强度随时间的变化会编码图像信息。这些强度变化随后用于通过将适当的时间强度段分配到帧存储中来重建图像。帧存储与样本中焦点的位置同步填充。帧具有x乘以y个像素(像素)的预定义大小。元组(x,y)称为扫描格式或有时称为扫描分辨率(不要与光学分辨率(2)混淆)。

因此,共聚焦显微镜的计算得出的FN是样品的扫描视野大小乘以放大倍数。成像期间不会出现中间图像。通过调整扫描幅度,可以将观察到的场从最大值减小到零(3)。零振幅表示在样品中观察到一个固定的斑点,这是荧光相关光谱法所必需的( FCS )。中间振幅会产生小于最大值的场,从而构成放大功能,因为较小的场会显示在相同的监视器尺寸上,因此代表了额外的“放大”(不是光学放大倍数)。

Optical resolution

光学分辨率(dA)可以通过阿贝公式确定:

dA 是两个可以分开的非常小的“点”物体的距离,l是照明光的波长,NA是物镜的数值孔径。显然,透镜的放大率对光学分辨率没有影响。

为了在扫描样本并将强度存储到数字图像时保持光学分辨率,从样本投射回的像素的尺寸应小于光学分辨率。否则,数字图像的信息少于光学图像。通常,我们假设d的1/2倍A 作为适当的过采样(特殊的图像恢复算法通常需要更高的过采样,最多四倍)。所需的最小像素尺寸(dp),因此可以计算为:

Resolved Field

为了表征共聚焦扫描显微镜的功能,不宜讨论视场 作为光学校正的整个区域,而是可以在不损失光学分辨率的情况下进行扫描的领域。尽最大可能 长方形 scan format (x,y)最高,我们可以计算出解析的字段大小(d屏幕):

例如,如果假设λ= 500 nm和NA = 1.4,则dp = 90 nm。使用x = y = 1000像素的扫描格式,则该场将覆盖90 x 90 µm的区域。

如果使用放大倍数为63x的镜头,则计算出的视场(FN的等式1)将对应于中间像平面中5.6 mm x 5.6 mm的面积。这样,该正方形的直径仅为8 mm,比设计显微镜的典型FN小得多。

将方程式5乘以所用透镜的放大倍数,得出的量等于FN,但现在考虑了实际的扫描条件。我们称其为已解析的字段编号RFN:

Examples:

我们假设指定的FN为22毫米(图1,左)。我们使用40倍放大倍数,NA为1.3的透镜,光波长为500 nm,并扫描x = y = 2496像素的正方形(考虑到仪器可以扫描的最大像素)。 RFN等于13.6毫米。

在第二个示例中,我们假设FN为25毫米的显微镜(图1,右)。使用相同的透镜(40x / 1.3)和光波长(500 nm),但该仪器的最大尺寸限制为1024个像素。使用公式6,我们计算出RFN为5.6 mm。尽管对于此示例,FN在名义上比前一个要大一些,但是可用的扫描区域要小得多(如果我们不接受分辨率的损失)。

References

  1. ISO19012-1显微镜-显微镜物镜的指定-第1部分:视野/平面的平坦度 //www.iso.org/standard/61652.html
  2. 超分辨率–关于光学显微镜分辨率的启发式观点 //www.yunhecy.com/science-lab/super-resolution-on-a-heuristic-point-of-view-about-the-resolution-of-a-light-microscope/
  3. 共振振镜扫描器的智能控制 //www.yunhecy.com/science-lab/smart-control-for-resonant-galvo-scanners/