Tutorial

Spectral Imaging

如何分离颜色

多参数荧光成像的目的是将各种荧光染料发出的光子收集到单独的检测通道中。为此,有必要在空间上隔离整个发射光谱的各个部分,即将这些部分指向不同的方向。传统上,这种分离是通过“第二分色镜”(称为“分束器”,即将照明与发射分开的主分束器)进行的。出乎意料的是,也可能使用棱镜(首选)或光栅。如果初级分离不充分,则可以通过根据数学上的光子颜色对其进行物理分类来进行这种原始的真彩色分离,并在数学上进行解混。

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二次分色镜

自大约1970年以来,在生物显微镜领域中对多参数荧光显微镜的需求日益增长。在最简单的情况下,用于单通道设置的滤波器和二向色性将固有地允许记录例如蓝色或绿色时呈绿色和黄色/橙色荧光 紫外线 激发(当时被遗忘的标准是Feulgen染色,可以通过不同的发射颜色辨别DNA和RNA)。广角镜通过使用彩色相机来满足这一要求。有时,尤其是对于定量测量,图像被拆分,并且两个通道在同一芯片上并行成像。最先进的是同时并行使用两个或更多摄像机。在真正的共聚焦扫描显微镜中,不可能分离感应目标。结果,通过添加第二(第三…)光电倍增管立即实现了多参数荧光。数据是并行记录的,或者直接显示在屏幕上,例如在显示器的3个颜色通道中,或以电子方式存储以供以后分析。要显示3个以上的通道,必须在3个可用的监视通道之间分配信息,这不可避免地导致分离度和强度分辨率的损失。但是,现代显微镜不仅要拍摄出出色的图像(无论如何我们只能用眼睛分辨出三个通道),而是以定量测量为目标。在这里,任何数量的通道都是有意义的,只要通道的数量不超过样品中的荧光色物质的数量即可。

将发出不同颜色的荧光染料的发射定向到传感器组的最明显方法是使用二向色镜。二向色镜将反射比二向色镜指定波长λ短的光0 并传输更长波长的所有颜色。对于“长通二向色镜”,这是正确的。 “短通二向色镜”将透射较短的波长并反射光谱的红色部分。在图2中,一组三个次级二向色镜S1,S2 and S3 用于将整个频谱分成4个不同的方向,传感器随后可以收集4个不同的通道。次级二向色镜必须根据使用中的荧光染料的光谱发射特性进行选择。结果,给定的集合可以适合许多类似发射的荧光染料,但是如果荧光染料组合具有明显不同的发射特性,则该测试组将失败。为了解决此问题,使用次级二向色镜进行分色的系统在每个拆分位置都配备有轮子或滑块。它们配备了一系列各种二向色镜,这些二向色镜允许一定数量的不同色带通过传感器。显然,此解决方案不是很灵活,需要大量的伺服技术和调整功能(预计可以在数月内保持稳定, 至少。如果安装了许多激光线,则潜在的发射带数将增加-因此需要次级分色镜的数量。对于白光激光源,发射滤光片的概念将无法合理地适应,并且只能安装连续可调的设备。数字 图1示出了从1995年开始的二向色性概念的实施。

Dispersion by prism

Isaak Newton爵士在1704年的“ Opticks”一书中描述了(故意)分离光色的最古老方法:使用棱镜。本文以序言形式显示了他从那本书中提取的图画的副本。今天,我们的解释是,较短波长的光比较长波长的光在光学不同介质的边界处会更强烈地衍射(得出简单的结论)。如果将多种颜色的混合物(如一组荧光染料的合成发射光)通过棱镜输入,则合成发射光将在光谱上分解。

分解强度取决于许多技术参数,但与样品或传感器无关。对于来自一组指向不同方向的荧光染料的发射问题,这是一种非常有效且直接的解决方案,可以在随后记录这些问题。在最简单的情况下,只需沿光谱放置一系列检测器即可。这个概念已经实现,但是在收集效率和灵活性方面存在严重缺陷。 更好的解决方案是多频带设备,它允许为要记录的每个传感器分别选择全谱的任何部分。

棱镜具有白色(平坦)透射的优点,即,棱镜没有吸收调制(在指定的光谱范围内)。透射率和色散与偏振方向无关。这是重要的事实,因为荧光染料的发射始终是非偏振的。最后但并非最不重要的一点,色散仅在一个方向上发生-没有其他“阶次”可以按选定的阶次降低强度。

关于分散光谱的线性有一些讨论。基于棱镜的光谱相对于波长不是线性的。对于技术设计,这不是问题,只要不限于使用线性检测器阵列(例如多阳极光电倍增管或类似设备)即可。

光栅色散

棱镜的另一种色散元件是光栅。透射光栅和反射光栅都在使用中。在用入射光束照射时,光栅的周期性结构将导致光偏转到各个方向(通过干涉过程)。

直线方向(0 顺序)不显示任何颜色分散。 1英石 订单通常是选择的方向。在这里,光被散布到一个光谱中,非常类似于棱镜中的色散。不过,还有更多的订单,例如2个nd 和更高的订单,但同样反映1的订单英石 … n 光栅另一面的顺序正常。光栅制造的技术是将尽可能多的能量集中在一个单阶中。

对于平行或垂直于线(槽)方向偏振的光,光栅的性能也有很大不同。垂直波在最佳情况下(取决于各种参数)可以执行相当有效的频谱,而平行波则在远离火焰波长的两个八度内显着下降-大约为零。由于荧光是非偏振的,因此总效率由垂直效率和平行效率之间的平均值来描述。降到30 %在200以内是常见的 可见范围内的nm。

对于效率(光子收集性能)是关键问题的仪器而言,这使光栅成为非常低效且不合适的分散设备-共聚焦荧光显微镜就是这种情况。如果实施,通常会附加一系列其他设计元素,以尝试将丢失的光子引导到传感器(有时称为"photon recyclers").

更为复杂的是,与棱镜相比,光栅显示的杂散光损耗要大得多。

图6:光栅产生许多阶,其中包含入射光束的光谱。绝对效率由所用阶数与入射光束之比计算得出。

分散剂的比较

如上文所述,共聚焦显微镜中荧光发射分散的各种概念各有利弊。下表显示了比较概述。显然,棱镜是完成任务的最佳选择。

棱镜光栅二向色性
变速箱0.950.75:0.9(火焰)– 0.6(红色)0.9(规格深度)
传输p0.950.6:0.8(闪耀)-0.4(红色)0.9(规格深度)
透射率(λ)白色的烈火取决于规格取决于
更高的订单损失是的
全光谱检测是的是的否(边缘不是无限陡峭的)
与设置无关是的是的否(分散程度取决于实际元素)
机械稳定是的是的否(滚轮,滑块...)
杂散光问题低的高的低的