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果蝇组织的优良超微结构保存和结构对比。

高压冰柜EM ICE应用说明

组织的最佳结构保存只能通过高压冷冻来实现。但是,在最佳条件下制备样品具有挑战性。本文详细说明了如何解剖,高压冷冻和冷冻替代果蝇组织样品,以获得高结构完整性,以用于随后的电子显微镜分析。

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介绍

果蝇幼虫肠道是简单的上皮,分为前肠,中肠和后肠三个不同的区室。前胃是位于前肠和中肠交界处的球根状器官,并起控制食物进入中肠的瓣膜的作用。前列腺的后端有四个长的手指状突起,称为胃盲肠,负责大多数消化酶的主动分泌(1,2,3)。

程序

将果蝇第三龄幼虫的前中肠的一部分(由前胃和胃盲肠组成)在施耐德氏培养基中切开,并转移到腔深为0.2毫米的A型Planchet中。小心地除去过量的施耐德培养基,然后立即吸取1μl20%BSA / PBS。检查样品方向后,将B型平头刀放在顶部,且平面朝下以密封组件。

使用Leica将组装好的标本室冷冻 电磁 ICE高压冷冻系统。将冷冻的样品转移至液氮蒸气中的冷冻管中,并转移至预冷的(-90°C)冷冻替代装置(Leica 电磁 AFS)。使用以下程序,使用0.12%乙酸铀酰水溶液在无水丙酮中的混合物进行冷冻取代:-90°C保持45小时,然后从-90°C缓慢升温至-50°C(15°C / hr)。在-50℃下,除去冷冻替代溶液,并用丙酮将样品洗涤3次,历时10分钟。通过将样品在丙酮中逐渐增加浓度的Lowicryl HM20树脂(25%,50%,75%)孵育,最后3次与100%树脂孵育48小时,从而进行树脂渗透。将样品从-50°C逐渐升温至24°C(5°C / hr),然后 紫外线 在48小时内聚合。在Leica上切割超薄切片(50-60 nm) 电磁 UC7超薄切片机,用2%的乙酸双氧铀水溶液处理10分钟,柠檬酸铅处理2分钟。数字显微镜的显微照片是在JEOL JEM 1200 EXII上以80kV运行的,并配备了底部安装的AMT XR-60数码相机。

Results

References

  1. Demerec,M.Drosophila的生物学,(1950年),纽约,John Wiley and SonsInc。伦敦查普曼​​和霍尔有限公司
  2. Bodenstein,D.Drosophila的胚后发育。(1950),pp.275-367,Hafner,New York;
  3. 果蝇的胚胎发育:J. A. Campos-Ortega和V. Hartenstein。纽约:施普林格出版社。 (1985)