在线联系我们
文章

的Fundamentals and History of 荧光性 and 量子点

At some point in your research and science career, you will no doubt come across 萤光 microscopy. This ubiquitous technique has transformed the way in which microscopists can image, tag and trace anything from whole organisms to single proteins and beyond.

在本文中,我们将研究什么是"萤光",其定义背后的历史和基本物理学,绿色荧光蛋白( 绿色荧光蛋白 )以及荧光探针(包括量子点)的迅速扩展领域。

s

主题 & 标签

How do we define "fluorescence"?

输入短语"definition of 萤光"进入任何搜索引擎,您将获得以下短语或类似内容;

"The EM ission of visible or invisible radiation from 某些物质 as a result of incident radiation of a 较短的波长 such as X-rays or ultraviolet light."

这个定义与如何相关 萤光 microscopy (Figure 1)? 的"incident radiation of a 较短的波长"只是用来"excite"样品中的荧光团。该光可以包括可见光谱,紫外线( 紫外线 )和红外线( 红外 ) and the source in a microscope can range from a mercury or xenon arc lamp to lasers. 的荧光团 ("certain substances" in the above definition) are chemical compounds which have special properties whereby they can reemit higher 波长 light/photons upon 前 citation by light which has a lower 波长.

波长的基本单位是米和"wavelength" is defined as the distance between two successive peaks or troughs of a light wave. 的symbol for 波长 is the Greek letter lambda (l). 的波长s which are typically used in microscopy are in the nanometre (nm) range within the visible spectrum between 400 and 700 nm, the 紫外线 低于400 nm的光谱和 红外 光谱始于700 nm(图2)。

荧光团 s are categorised by their 前 citation and EM ission 波长s which is usually in the form of a 图形 显示最大峰。荧光团在称为"ground state"。当它们吸收光子(来自"shorter 波长"光),光子的能量将荧光团的电子提高到更高的能量"excited" state. 的激动 electrons do not remain in this state, but lose the vibrational energy and EM it a photon of a longer 波长 on their return to the 基态. For the 荧光团 used in microscopy, one complete cycle from 前 citation to the return to ground takes in the region of 0.5 to 20 nanoseconds.

荧光团 前 citation and EM ission 波长s are commonly abbreviated as the Greek letter lambda with a subscript "ex" (excitation) or "em" (emission; l 或l EM )。

每个荧光团都有一个不同的最大激发和发射光谱,该属性用于区分 不同的目标 在同一标本中。例如,使用荧光染料DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)突出显示细胞中的核蛋白,同时使用荧光标记的鬼笔环肽突出显示肌动蛋白的细胞骨架。 

The Jablonski图 of 萤光

的Polish physicist Professor Aleksander Jablonski (1898-1980) was the first to describe the 地面/励磁/发射之间的循环 在三级能量图中,简称为"Jablonski Diagram".  1930年,他获得了华沙大学博士学位,其论文题目为"激发光波长变化对荧光光谱的影响"。 1933年,他发表了论文("染料中抗斯托克斯荧光的效率") in Nature which contained the Jablonski图. This simple yet effective illustration of the behaviour of 荧光团 highlights the 前 citation from 基态 to 激动 state and back to ground with the EM ission of a photon of longer 波长 (Figure 3).

Although Figure 3 is a simplified Jablonski图, it should be noted that 荧光团 can 前 ist in many different states of 前 citation and EM ission. Furthermore, 荧光团 may return to ground via varying states of relaxation known as "三重态" 取决于分子的电子自旋。

The 斯托克斯班

乔治·加布里埃尔·斯托克斯爵士(1819-1903)是爱尔兰的数学家和物理学家,在他的一生中,他在光学和光学领域取得了许多发现和进步。 1849年,他被任命为剑桥彭布罗克学院的卢卡斯数学教授,并一直担任这一职务,直到1903年去世。他写了一篇精美的描述性论文,该论文发表于1852年,"关于光的可反射性的变化 " [1]. 的language used in this text is unlike that which we are used to in modern day scientific literature. Here are two brief 前 tracts of the wonderful language which Stokes used;

"到去年秋天末期,当季节的晚期提供了很少的观察机会时,我从不同的来源获悉,已经提到的这种黄色玻璃具有很高的内部分散性,因此已经被着色了。与铀的氧化物。"

和:

"看到管子陷入不可见的光线时瞬间亮起,肯定是一个奇怪的景象:从字面上看,它确实是 黑暗可见。总的来说,这种现象看起来有些古怪。"

的"Stokes Shift" was later named in his honour. When the 激动 electrons return to the 基态 and EM it a photon of light, the 波长 is always longer than that which was used to 激发 the fluorophore. This is due to the property of light whereby 波长 is inversely proportional to radiation energy. 的斯托克斯班 describes the difference (in nanometres) between the peak 前 citation and the peak EM ission 波长 of a fluorophore (Figure 4). 

Distinguishing between the 前 citation and EM ission from a fluorophore is proportionally easier with an increase in the 斯托克斯班. 荧光团 s possess unique characteristics in terms of their 斯托克斯班 which is due to their electron configuration and molecular structure.

绿色荧光蛋白的发现与应用

首先是斯托克斯(Stokes)这个词"fluorescence"用来描述他所观察到的现象,但历史可以追溯到1565年。一位西班牙医生兼植物学家尼古拉斯·蒙纳德斯(Nicolas Monardes)描绘了一种奇怪的蓝色,是从墨西哥树上注入木材而成的, 木质素。尽管有这些早期的观察结果,但大约400年后,仍在活生物体中报告了绿色荧光物质。 1955年,达文波特和尼科尔发表了一篇论文 [2] 描述了被称为水母的亚类嗜酸性粒细胞中的光致组织 水母。当时,这项工作的作者并未意识到嗜酸性粒细胞含有 绿色荧光蛋白 ( 绿色荧光蛋白 )。

直到1962年,下村修(* 1928)发表了一篇论文 [3] 其中光致成分被识别为蛋白质。他们与普林斯顿大学的教授(弗兰克·约翰逊)合作,从生物发光的水母中收集了样本 维多利亚水母。他们有一种从水母中分离荧光蛋白的独特方法,即通过棉袋挤压分离的生物发光组织以产生溶液,下村称之为"squeezates".

1994年,哥伦比亚大学的马丁·查尔菲(* 1947)教授编辑了一篇论文,证明该基因编码 绿色荧光蛋白 可以在原核和真核细胞中功能性表达(即 大肠杆菌 和神经元 秀丽隐杆线虫) [4]. 的paper stated that "because 前 ogenous substrates and cofactors are not required for this 萤光, 绿色荧光蛋白 表达可用于监测生物体中的基因表达和蛋白质定位。"正是该出版物为广泛使用该产品铺平了道路。 绿色荧光蛋白 在生物学研究中。

一年后,圣地亚哥·加利福尼亚大学的罗杰·钱(Roger Tsien)教授(1952-2016)(一直在研究野生型突变体) 绿色荧光蛋白 )在《自然》杂志的科学通讯中发表了他的作品 [5]. This discovery of a single-point mutation (S65T) was chosen by Tsien and colleagues as it had the longest 前 citation and EM ission 波长s (490/510 nm) which rendered it more photostable and resulted in the well-known 绿色荧光蛋白 激发/发射峰。

2008年,下村,钱和查尔菲被共同授予 诺贝尔奖 在化学领域的角色和发现 绿色荧光蛋白 。 Shimomura在他的诺贝尔奖演讲中说:“当我发现 绿色荧光蛋白 1979年,我以为我已经尽力了 绿色荧光蛋白 ,并决定终止我在的工作 绿色荧光蛋白 为了集中精力从事生物发光的研究”。他继续承认“ 绿色荧光蛋白 是一种美丽的蛋白质,但在发现后的30年中仍然无用。”

自从Tsien被发现以来,他的实验室设计了许多 绿色荧光蛋白 它涵盖了大部分可见光谱,确实改变了光学显微镜和成像领域。多亏了这样的基因工程 绿色荧光蛋白 可用的颜色范围从光谱的蓝色部分(EBFP; 380/460 nm)到光谱的黄色部分(YFP; 514/527 nm)。 

Reporters and probes

除了成像领域外,荧光团还可以用作"reporters" to study gene 前 pression in cells and organisms. 的enzyme luciferase, as well as the gene encoding 绿色荧光蛋白 其中,通常用于检查特定基因是否由细胞表达的基因。用基因修饰的病毒DNA或质粒转染生物或细胞,当表达目标基因时,该质粒会发荧光。然后可以在转染的细胞中观察并检查细胞内的细胞器或目标部位。

被标记的抗体(或"tagged")与荧光团通常称为"荧光探针"。在广泛使用之前 绿色荧光蛋白 以及随之而来的其他荧光团,标记抗体的两种最常用的荧光团是 FITC (异硫氰酸荧光素)和TRITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)。虽然 FITC 仍然使用TRITC和TRITC,并且该领域已经取得了重大进展,至少可以说,荧光团和探针的选择范围很广。

当然,当今实验室中使用最广泛的荧光团之一是"Alexa Fluor" dyes. 的current range of Alexa Fluor dyes available spans the visible spectrum with 前 citation 波长s ranging from 346 to 784 nm. 

Quantum Dots

量子点(或"Qdots")是在1981年由俄罗斯科学家Alexey Ekimov在圣彼得堡的瓦维洛夫国家光学研究所工作时在玻璃基质中首次发现的。但是,Qdots的第一种胶体溶液是由在AT从事半导体工作的Louis Brus发现的&新泽西州的T贝尔实验室。他现在是哥伦比亚大学的化学教授。在1983年和1984年发表的两篇论文中,布鲁斯将Qdots描述为"小半导体微晶".

量子点表现出特殊的行为-尽管它们包含的原子数少至100至100,000,但它们却表现出好像由单个原子组成的特性。但是,它们确实符合荧光团的特性,从而它们可以吸收光能,被激发并在返回基态时释放光子。但是它们发射的光的波长取决于Qdot的大小-Qdot越小,发射波长越短。此属性是由于较小的Qdot具有较大的"minimum band gap"。这是将电子激发到更高能量状态所需的能量。由于较小的Qdot需要更多的能量进行激发,因此它们随后发出的波长更短(波长与激发能量成反比)。

差不多20年后的2002年,Qdots成为加利福尼亚州量子点公司(Quantum Dot Corporation)的生命科学研究人员的商业产品。

量子点 是用于荧光应用的非常明亮且稳定的工具。研究表明,尽管与有机染料相比,Qdot的亮度要高出几个数量级,但是与传统染料相比,Qdot的亮度却有所不同。 [6]。就光稳定性而言,据报道,Qdots的稳定性是传统荧光团的100倍,其中一种是 体内 影像学研究,它们持续发荧光长达四个月 [7].

在常规的荧光探针中,可以将一种或多种荧光团附着到单个目的抗体上。但是,由于Qdot的表面积非常大,许多分子和抗体可以附着到单个点上,这可能具有许多优点,包括荧光信号放大。 Qdots的使用在多重分析中也具有优势,在多重分析中可以同时成像各种波长。在这种分析中,唯一的变量是研究者选择的Qdot的大小(因此是发射波长)。可以用白光同时执行多种Qdot的激发,从而无需使用多个激光器和进行多次调整即可形成最终图像。 

References

  1. 关于光的可反射性的变化; G.G.斯托克斯,M.A.,F.R.S。菲尔反式R. Soc。 nd 1852 142,463-562,1852年1月1日出版; http://rstl.royalsocietypublishing.org/content/142/463.full.pdf+html
  2. 水母的发光 D.达文波特J. A. C. Nicol,1955年11月29日发布。DOI: 10.1098 / rspb.1955.0066; http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/144/916/399
  3. 水母发光蛋白的提取,纯化和特​​性,水母发光蛋白是一种发光的水母,水母。 J Cell Comp Physiol. 1962 Jun;59:223-39.; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13911999?dopt=Abstract
  4. 绿色荧光蛋白作为基因表达的标记;  科学   1994年2月11日:第一卷。 263,第5148期,第802-805页DOI:10.1126 / science.8303295; http://www.sciencemag.org/content/263/5148/802?ijkey=e60d69b507876bb025397e40e06389c288d2e92e&keytype2=tf_ipsecsha
  5. 改善了绿色荧光; 《自然》第373卷,1995年2月23日; http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Heim%201995%20Nature%20-%20Improved%20GFP.PDF
  6. QD与Alexa:免疫细胞化学的有前途的工具的现实; 纳米生物技术杂志; http://www.jnanobiotechnology.com/content/7/1/4
  7. 小鼠量子点的无创成像; 生物缀合物化学, 2004, 15 (1), pp 79–86 DOI: 10.1021 / bc034153y;发布日期(网络):2003年12月30日; http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bc034153y