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衰老的线粒体假说

激光显微切割在神经退行性疾病研究中的应用

我们为什么变老?多年来,研究科学家一直在寻找这个问题的答案,尤其是在老年人(例如Morbus Parkinson)中神经退行性疾病增加的背景下。分子生物学研究表明,线粒体在衰老过程中起主要作用。 PD医学博士慕尼黑大学/Großhadern大学神经病医院的Andreas Bender正在研究线粒体衰老假说,该假说认为氧化损伤和mtDNA突变的分子恶性循环是神经元功能失调的原因。在这一研究领域中,激光显微切割技术是一种有价值的技术,可从单个细胞类型中获得均质的样品材料,从而获得有意义的结果。

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Research focus

我们的目标是在单细胞水平上研究为什么某些细胞类型比其他类型的细胞更容易受到神经变性疾病(如Morbus Parkinson)的影响。通过激光显微解剖从人类尸体脑组织中提取这些细胞后,我们将其进行分子生物学检查。特别是,我们正在寻找对线粒体DNA(mtDNA)的损害。迄今为止,线粒体尚未通过单细胞分析进行彻底研究,尽管越来越多的证据表明它们可能在神经退行性疾病和衰老过程中发挥重要作用。

衰老的线粒体假说

线粒体是非常特殊的细胞器-它们有自己的遗传物质mtDNA。它们通过呼吸链为细胞产生能量,从而自由基被释放为细胞呼吸的废物。这些氧化性氧化合物随后会破坏相邻的mtDNA。现在认为,在一个人的一生中,会积累大量mtDNA损伤,一旦达到一定的阈值,就会损伤细胞并最终导致细胞凋亡。大脑受到的影响尤其严重,因为脑细胞没有得到明显的替代。因此,假定神经退行性疾病的原因之一是某些类型细胞的加速死亡。就帕金森氏症而言,这些细胞主要是黑质(位于中脑的核心复合物)产生多巴胺的细胞。

图1:线粒体衰老和神经变性理论的分子恶性循环。即使在正常条件下,呼吸链中也会形成活性氧(ROS)。这种氧化应激会破坏邻近的mtDNA,从而破坏线粒体蛋白。逐渐地,呼吸链的功能被破坏,导致更高的ROS产生。结果是ATP的产生减少,最终导致细胞功能和细胞凋亡受到干扰。

处理脑样本

处理人脑样本不仅带来特殊挑战,而且受到限制。不仅人类尸体的脑组织只能以极少量获得,而且只能通过特殊的脑库获得。我们的部分工作包括基于RNA的基因表达分析,这在很大程度上取决于组织的质量-从患者死亡,器官摘除和冻结到样品从头到尾充分冷却之间的时间。除霜后仅几个小时,RNA被酶降解。如果这是在进行实验之前发生的,那么基因表达的结果将是无用的。

当先前同意为研究目的而采集组织样本的合适患者死亡时,将立即通知相关的国家脑库。尽快将尸体运送到病理研究所,并按照标准化方案将大脑移开。然后至少立即将大脑的一半磨砂,然后可以在–80的温度下将其质量保存很多年。 ℃。为了进行实验,将材料加热到–20 ℃。然后产生厚度为20微米的冷冻切片,并将其安装在用于激光显微切割的特殊样品载玻片上。然后将它们立即染色,然后解剖所需的细胞并对其进行基因表达处理。

Results

在我们的一项研究中,我们比较了帕金森氏病患者的死后颅骨切片与相同年龄的健康对照受试者的样本。通过对样品染色,我们能够看到黑质中的许多细胞都存在线粒体功能障碍。通过激光显微切割提取这些细胞以检查其呼吸链和mtDNA。这项检查揭示了mtDNA突变(缺失)的比例很高。

然后,我们比较了帕金森组和对照组的大量细胞,发现帕金森组中的缺失数量明显更高,实际上比过去想象的要多得多。二十年来,人们知道mtDNA发生了变化,但我们一直认为这只是百分之几的问题。使用单细胞技术,我们能够证明帕金森氏症患者的mtDNA的50%至60%受到损害,从而导致受影响细胞的能量严重不足。

令我们惊讶的是,60至70岁的对照组患者中也有很多突变,尽管明显少于帕金森组。因此,在第二步中,我们检查了从几个月到一百岁的所有年龄段的对照组样本。我们发现mtDNA缺失随着年龄增长而增加。我们出生时几乎没有缺失,而且在我们生命的某个阶段,突变的临界阈值达到了50%到60%。

图2:(A)多巴胺能黑质神经元的细胞色素c氧化酶(COX)和琥珀酸脱氢酶(SDH)染色。正常神经元是COX阳性(棕色)。 mtDNA缺失水平高的神经元是COX阴性(蓝色)。 (B)用激光捕获显微切割术切出COX阴性神经元(中图),并在PCR管的盖子中识别(右图)。 (C)实时PCR定量单个COX阳性和COX阴性神经元的mtDNA缺失。 COX阴性神经元的mtDNA缺失水平较高。 (D)单个神经元的远程PCR显示mtDNA缺失的克隆扩增(条带比右侧的mtDNA野生型条带短)。 (E)分析对照中多巴胺能神经元的mtDNA缺失负荷,显示其缺失水平随着年龄的增长而稳定增加。

激光显微切割的作用

激光显微切割在我的工作中起着极其重要的作用,因为  解剖单个细胞可确保我们真正检查感兴趣的细胞。在激光显微切割时代之前,大多数检查都是在匀浆上进行的。它们包含不同类型的细胞,因此我们正在研究的分子连接有时会在很大的背景噪音中消失。如果一种疾病仅影响一种特定的细胞类型(例如帕金森氏症),那么只有在我们能够分析均质细胞材料时,我们才能获得有意义的结果。这是激光显微切割的优势。

抗线粒体损伤的疗法–治疗衰老的可行机会?

当然,这种疗法原则上是可行的。一种方法是通过使用抗氧化物质防止细胞积累线粒体损伤。另一方面,正在进行有关如何使已经受损的细胞产生更多新的健康线粒体的广泛研究。但是,现在在日常的医院常规中预测结果是否与线粒体疾病相关还为时过早。

线粒体功能障碍当然不是衰老的唯一原因。最近的评论比较了关于我们为何变老的一百多个假设。即使我们设法保护了线粒体,也不能得出结论认为该细胞可以过长而健康的生活。这可能会引发新的问题。保存线粒体作为青春源泉的良方;这太简单了,尽管当然这将是我们工作的一个不错的方面。