Story

原发性牛铬斑细胞中膜的超微结构保存及改进的可视化

用高压冻结捕获动态过程

可以使用Live-Cell成像技术研究蛋白质运输,再循环和降解以及信号转导的细胞内动态事件。然而,传统的光学显微镜具有有限的分辨率,其不足以可视化在其蜂窝环境中以纳米刻度发生的细胞过程。广泛用于在超微结构水平下可视于可视化分子复合物,细胞细胞器,组织和整个生物体的电子显微镜。经典地,当通过电子显微镜观察到生物学样本时,通过相对缓慢(扩散限制)的化学固定来固定它们,并导致细胞膜的收缩和畸变,因此不希望可视化快速细胞事件。快速冻结的冷冻固定是迄今为止最有利的方法,使得能够在“近距离”状态下立即逮捕生理事件。本申请说明描述了与化学固定制剂相比,进行高压冻结和冷冻替换牛肾上腺铬斑铬细胞的高压冻结和冷冻替换,以改善膜的可视化。

Authors

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Introduction

在肾脏上方的肾上腺髓质中发现斑铬细胞。它们是一种由周围神经控制的神经内分泌细胞。它们的功能是通过释放儿茶酚胺(肾上腺素,去甲肾上腺素)和包含在≈300nm致密核心囊泡中的各种肽来调节对压力的反应 [1].

Procedure

用含有胶原酶P,胰蛋白酶抑制剂和牛白蛋白血清的洛克溶液消化了从成人牛源自成人牛的新鲜肾上腺腺。纵向切割腺体以暴露消化的髓质。将髓质剁碎在洛克的溶液中,并通过250μm尼龙网过滤。将滤液以50g离心4分钟 [2]。然后除去上清液,并将颗粒重悬于补充有10%胎牛血清的预热DMEM低葡萄糖培养基中。最后,通过重力沉淀细胞,小心地除去培养基。将大约0.5μl的细胞沉淀转移至3mm型 - 一种地图集,深度为200μm预涂覆的DOPC脂质。填充颗粒溶液的整个体积。将-B型法兰氏料放置在顶部,平坦表面向下密封组件。使用组装的样品室使用 em. 来自徕卡微系统的冰高压冷冻系统。将冷冻样品在液氮蒸汽下转移至干酪,然后将预冷的(-90℃)冷冻替换装置( em. 来自Leica Microsystems的AFS)。

使用1%单宁酸在干丙酮中的溶液进行冻结24小时,然后交换到2%乙酸铀酯,1%戊二醛和3%H的混合物2o在丙酮中21小时。然后用预冷的干燥丙酮洗涤样品3次1小时。我们没有使用OSO4。相反,我们使用单宁酸与乙酸铀酰组合 。将温度从-90℃至-30℃缓慢升高到96小时(0.6℃/ h)和-30℃至21℃(1.4℃/ h)。将样品与在室温下的丙酮中的丙酮中的分离。然后进行嵌入和嵌入嵌入-812。超薄部分(50-60nm)切断了一个 em. UC7来自Leica MicroSystems的Ultramicrootome,并用柠檬酸铅后灭活5分钟。用JEOL JEM-200CX电子显微镜在120 kV下运行并配备了数字显微照片,并配备了底部安装的AMT XR-100 CCD. camera.

Results

代表性的电子显微照片显示了细胞形态已被保存。他们还表明,大的致密芯囊泡呈圆形(图1A-C,2和3B)。化学固定的VS冷冻固定电池的比较如图3所示。在化学固定细胞(图3A)中观察到高度细长的囊泡,但不在冷冻固定的细胞中观察到(图3B)。这些结果表明,我们的冷冻固定方案保留了肾上腺斑铬细胞中囊泡的椭圆形/圆形,常用的细胞模型用于研究外尿精和内吞作用。

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