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讲解

使用旋转设备进行DLS样品安装

TCS SP8 DLS 数字LightSheet协议

TCS SP8 DLS 显微镜利用将光片显微镜技术集成到共聚焦显微镜中的创新概念。由于其独特的光学结构,可以将标本/样品固定在标准玻璃底培养皿上,就像用于标准共聚焦成像一样,但是与传统的安装程序相比,只需做一些改动即可。

在布鲁诺·科塞梅利·维卢蒂尼(MPI CBG),Pavel Tomancak(MPI CBG)和Emmanuel Reynaud(UCD)的专家支持下,在德累斯顿MPI CBG的2018 EMBO Lightsheet课程的框架中获取了图像。

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Introduction

对于图像采集,样品制备有两个主要要求。样本需要放在盖帽的两个反射镜之间的检测物镜的焦平面中。此外,需要将其从培养皿底部稍微抬高,以使镜子/光片到达标本的远端。

将样品放置在样品空间的自由区域中的一种简便方法(请参见上图)是使用FEP(氟化乙烯丙烯)管(请参见下图)。 FEP的n值为1.338,非常适合对浸入水溶液中的标本进行成像(至少在使用具有中等数值孔径[NAs]的物镜时)。

对于SP8 DLS 成像后,可以使用FEP管将标本放置并固定在适当的位置(请参见下图)。

这种样本安装的优点是:

  • 易于处理和
  • 使用低浓度的脚手架培养基(例如琼脂糖或甲基纤维素)的可能性,该培养基可在生理条件下长期提供足够的样品限制 体内 成像。

缺点是难以对齐标本,使感兴趣的区域暴露在荧光检测侧。

为了克服该缺点,在保持上述优点的同时,设计了一种旋转装置,该旋转装置允许容易地调整FEP管的角度,从而可以最佳地对准样本以进行成像。此类设置先前已在其他地方进行了演示 [1,2,3] .

材料和方法

样品旋转装置(见上文, 158007064 DLS 影像附带:

  • DLS 旋转装置
  • 显微镜玻璃盖玻片(21 x 26毫米);和
  • FEP管(Camitec,外径2.00毫米,内径1.80毫米)。

但是,没有用于密封旋转装置附带的盖玻片的硅酮或其他材料。

步骤1:清洁FEP管(推荐步骤)

如考夫曼的报告所述 等。  [4]FEP管在使用前应按以下方式处理:

  • 首先,所有溶液必须脱气并用注射器过滤(Millex-HV,PVDF,0.45 µm);
  • 用1 M NaOH(Merck)冲洗;
  • 将它们置于0.5 M NaOH中并超声处理10分钟;
  • 用双蒸馏水冲洗2O和70%乙醇
  • 在70%乙醇中超声处理10分钟;
  • 用双蒸馏水冲洗2 O; 和
  • 最后,储存在双蒸馏H中2

步骤2:用玻璃盖玻片密封旋转装置

通过以下方式将盖玻片密封到旋转设备上:

  • 在旋转装置底部的凹槽的内边缘涂上硅胶(请参阅下面的A);
  • 添加一个保护玻璃并轻轻按压玻璃以确保其在所有位置均能均匀放置以实现良好的密封(请参阅下面的B);和
  • 要检查腔室密封,请向旋转装置中加入一些蒸馏水,看看是否发生泄漏(请参阅下面的C)。

步骤3:将样本放入FEP管中

将标本放置在安装介质中,并用移液器或注射器将其吸入管中(如下所示)。

FEP管的长度必须为38毫米。

步骤4:将FEP管插入旋转装置

将黑色帽盖在FEP管的两侧(请参阅下面的A和B)。

如下图所示,将FEP管的一端插入旋转装置的插针(1)中,同时带有黑帽和磁铁(2)。

最后,将管的另一侧固定到位(下图中的1)。

步骤3:开始图像采集

将玻璃底部培养皿放在培养皿顶部 TCS SP8 DLS 扫描阶段(请参见下文)。

注意: 旋转设备仅与以下z-Galvo平台插入件兼容:

  • 158004118可旋转刀片反向和
  • 158004119插入通用。

小心:仅在初始化后将旋转设备放在z-Galvo平台上。另外,在改变(照明)物镜时要注意。旋转设备的轮子向下伸出,可能会意外碰到物镜(最好先从转塔上卸下笨重的物镜)。

Results

使用随附的LightSheet向导 LAS X软件,您现在可以获取标本的图像。

图12:从不同侧面观察到的果蝇胚胎。从3D图像堆栈中获取单个飞机。由Pavel Tomancak提供, MPI-CBG ,德国德累斯顿。