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DNA分子的可视化

使用BAC铺展,醋酸铀酰染色和精确的低角度旋转阴影

具有重金属(如铂)的精确低角度旋转阴影可用于透射电子显微镜(透射电镜)观察先前在薄的,低颗粒和电子透明的碳膜上吸收的物体的分子细节。 

为了获得最高的对比度和更好的图像质量,至关重要的是涂层必须具有方向性,并且必须与样品成精确的角度。整个样品表面的金属层细小颗粒和涂层材料的均匀厚度也是获得高质量的关键要求 透射电镜 图片。 这需要电子束蒸发的方法,并且没有其他涂层技术可以提供可比的结果。电子束蒸发会产生蒸发的物料流,该物料流的方向性非常强,非常均匀,冷却且颗粒细小。

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低角度旋转阴影

随着新一代 电磁 ACE600电子束蒸发器可以生产均匀,非常薄和低颗粒的电子透明碳层,用作吸附生物分子(包括DNA分子,蛋白质或DNA-蛋白质复合物)的载体。然后,使用精确且可再现的遮蔽角对吸收在薄碳层上的单分子或大分子复合物进行遮蔽,从而获得高对比度 透射电镜 图片。本文中应用的协议侧重于在DNA分子可视化中使用电子束蒸发,该协议最初由苏黎世联邦理工学院的JoséSogo博士的实验室建立,随后被实施,改进并提供给科学工作者。由苏黎世大学IMCR研究所的Massimo Lopes教授的实验室组成的社区[1]。由于此过程的详细信息最近已更新 [1],我们将简要介绍该协议的关键步骤,并添加与该应用的使用特别相关的实验详细信息 电磁 ACE600涂布机在此定义明确且经过尝试的实验工作流程中进行了比赛。

该过程的关键步骤,对DNA样品的优势和要求

该协议适用于纯化的DNA分子。适用于此步骤的DNA样品必须完全不含蛋白质和RNA分子。利用这种技术,可以根据两种形式的DNA纤维的不同厚度来区分双链(ds)DNA和单链(ss)DNA之间的差异(请参见下一段)。

协议的第一步

用甲酰胺和去污剂苄基-二甲基-烷基-氯化铵(BAC)产生溶液中DNA分子的平衡混合物。该混合物通过特定的撒布程序撒布在大水面上。 

协议的第二步

DNA分子的单分子膜与400目铜接触 透射电镜 网格上沉积了薄(4-8 nm),均匀且低晶粒的碳层(请参阅下一段)。的 透射电镜 然后将网格立即浸入乙醇和乙酸铀酰的溶液中。

协议的第三步

具有吸收的DNA分子的碳栅格受到8 nm铂的精确低角度旋转阴影影射。这是阴性染色,对于ds DNA纤维的可视化特别有效。

设置EM ACE600以生产高质量的碳层

高质量的碳层和精确的低角度旋转阴影与铂金的结合可产生高质量 透射电镜 DNA纤维的图像(请参见结果)。在此处描述的过程中,碳层是用 电磁 然后将ACE600涂布机放在V2高等级云母板上,然后浮在水面上,最后沉积在400目铜网上,而无需任何额外的甲醛或其他支撑材料。用这种方法产生的碳表面在吸收DNA分子方面具有很高的效率,不需要辉光放电。

带铂金的低天使旋转阴影-EM ACE600涂布机的操作和设置

吸收到400目铜网格碳表面上的DNA分子会受到8nm铂的精确低角度旋转遮蔽。网格固定在GRID平台上,以实现低角度旋转遮蔽 电磁 ACE600。在这种情况下,已经设计了两个不同的过程并按顺序运行。在第一个过程中,格栅上的碳表面以1°的涂层角覆盖有0.4 nm的铂,而GRID级没有旋转。在第二步中,以相同的涂层角度沉积7.6 nm的铂,但GRID台的旋转速度设置为1级。

提示和考虑以优化结果

设置蒸发参数(主要是蒸发功率)非常重要,这样既可以将蒸发速度保持在恒定值(0.03-0.08 nm /秒),对于生产碳层和低角度铂金旋转阴影。为了产生高质量和低晶粒的金属层,电子束枪和蒸发室必须保持非常清洁。

新一代电子束镀膜机的优势

新一代 电磁 与上一代MED蒸发器相比,ACE电子束涂布机具有多项改进。涂布机新组件的坚固性与众不同。电子束枪的设计和更新的电子设备可以在触摸屏显示器上显示所有参数的数字视图,这是一个很大的优势。此外,如果存在张力和电流参数超过某些值的情况,则不会出现蒸发的安全反馈将有助于保护机器并在更安全的条件下工作。

关于此处描述的特定应用,这意味着要利用非常精确且可重现的阴影角度,应突出显示通过触摸屏进行数字控制的精密电动平台的存在。最后但并非最不重要的一点是,可以使用非常直观的界面来存储,检索单个运行和设计过程的所有参数,并将其按顺序排列,这也使没有经验的用户也可以使用机器。

Results

透射电镜 BAC铺展,醋酸铀酰染色和低角度旋转阴影显像的溶液中质粒DNA分子的图片 电磁 ACE600电子束涂布机。标有黑色的比例尺(大约相当于1千克DNA)。红色箭头指示质粒分子的区域被缠绕并在该实验条件下具有变性的固有趋势。这些图像清楚地表明,该技术可以区分ss DNA和ds DNA之间的差异。通过这种技术,ds DNA纤维的厚度约为20 A°。在此实验条件下,0.36 nm大致相当于ds DNA的1bp。照片是使用FEI Tecnai12生物双显微镜拍摄的,该显微镜在80 KV下运行,并配备有由Digital Micrograph Software控制的侧面安装的Gatan Orius SC-1000相机。

References

[1]方法Mol Biol。 2018; 1672:261-294。 doi:10.1007 / 978-1-4939-7306-4_19

真核生物DNA复制叉的动态体系结构,通过电子显微镜观察。

Zellweger R1,洛佩斯M2

1瑞士苏黎世大学分子癌症研究所。

2瑞士苏黎世大学分子癌症研究所。电子邮件:[email protected]。 //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043630

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