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讲解

带有GSDIM的广角超分辨率

一个介绍

通过使用荧光显微镜,生物学上的巨大进步是可能的。到目前为止,由于物理限制,图像的分辨率受到限制。在过去的几年中,克服了这些局限性而不断发展的新方法将荧光显微镜的分辨率提高到了一个新的水平,从而为荧光显微镜带来了科学的可能性。 基态耗竭,然后返回单个分子 (GSDIM)是一个 定位显微镜 技术。该技术能够解决 details as small as 20纳米。这使得能够研究细胞中单个蛋白质和生物分子的结构并观察分子过程。的主要优势之一 GSDIM 相对于其他本地化技术的方法是 it can be used with 标准荧光标记 通常用于生物医学研究。

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定位显微镜

常规荧光显微镜图像的分辨率受衍射限制在发射光波长的一半左右。为了分离更靠近的荧光标记结构,需要一种解决方案来克服阿贝的衍射极限。超出衍射极限的最常见超分辨率成像方法是定位显微镜,SIM(结构照明)和 STED (受激发射损耗显微镜)。

基态耗竭,然后返回单个分子(GSDIM)是一种定位显微镜技术。通常,定位显微镜不会同时发光的荧光团,而是可以清晰地分离的单个荧光团,可以以纳米精度进行定位。随着时间的流逝,确定标记生物结构的每个荧光团的位置,并基于每个荧光团的位置信息在计算机上重建图像。面临的挑战是如何有效地将一组荧光团单个化以实现单分子检测。

GSDIM –分子基础

关键的一步 GSDIM 暂时关闭大多数荧光团,以允许单个荧光团的精确定位。为此,使用高强度的激发光,使得样品中几乎所有的荧光团都变黑,仅剩下单个,分离良好的荧光团发出荧光,这是纳米级精确定位的先决条件。

图1(右):示意图 GSDIM 简化的Jablonski图的方法。荧光团中的离域π电子可以处于例如基态S0>,处于激发态S1 (所谓的ON状态)或处于三重态或基本黑暗状态(两个OFF状态)。当发射荧光时,电子在地和激发态之间循环。与这些ON状态不同,处于OFF状态的荧光团不能发光。这些OFF状态通常使用寿命长,但是由于需要系统间交叉,因此很难实现。通过在包埋介质中设置正确的环境条件,并通过明智地选择用于免疫荧光的标准荧光团,可以通过以极高的光强度激发荧光团来可逆地关闭荧光团。当足够多的分子处于OFF状态时,可以检测样品中的单个分子。

分子状态之间的过渡

荧光样品一旦被(激光)光激发,电子就会被光子弹射到第一激发态。从第一状态返回到基态时,会发出能量稍低(红移)的光。较高的激光功率会增加可击中基态电子并将电子转移到激发态的光子数量。结果,在给定的时间内,样品中的更多电子在基态和激发态之间循环。发射的光子数量增加,可见较亮的样品。

激发光的进一步增加(例如来自高功率激光源的激发光)由于荧光发射降低而导致样品变暗。在此过程的开始,激发光的增加导致在基态和第一激发态之间循环的电子数量增加。一定比例的电子从激发态进入截止态。从第一激发态唯一可访问的子状态是三重态。进入三重态需要电子的自旋翻转。自旋翻转的发生概率非常低,因此是非常罕见的事件。结果,在样品的低曝光下实际上不存在截止状态。

截止状态具有长寿命(在μs到s范围内),并且具有处于截止状态的电子的荧光团不能再参与样品的荧光发射。随着时间的推移,尽管荧光团的总数没有改变,但越来越多的电子最终处于截止状态,并且样品显得较暗。只是“活动”或“可访问”荧光团的数量已更改。处于关闭状态的“泵浦”电子可以看作是可逆开关。电子停留在关闭状态时,关闭荧光团。当电子返回基态时,荧光团被激活,并再次发出荧光。电子分子状态之间的所有跃迁都是概率控制的过程,因此无法为给定的电子预测跃迁的确切发生。

定位精度高达纳米级

对于超分辨率成像,将激光功率保持在高水平,直到视场中只有少数荧光团发出光子为止。的"active"荧光团可以在基态和第一激发态之间循环多达数千次,从而在电子返回到关闭态之前产生光子“爆发”。光子“爆发”是用高灵敏度的EMCCD相机记录的。此外,在短时间内只有很少的电子在基态中扩散,从而导致了"单个分子返回的基态耗竭" (GSDIM)。通常,发射光子脉冲的荧光团在空间上被很好地分离,这允许将特定区域中的所有光子分配到单个分子。在这种情况下,所记录的衍射极限信号的中心与荧光团的位置相同。荧光团的位置可以计算到纳米精度。

图3(右):宽视场与 GSDIM。高尔基体膜蛋白Giantin和高尔基体蛋白GM130,分别用Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488进行免疫荧光染色。由日本东京大学医学研究生院细胞生物学与解剖学系冈田靖志博士提供。

为什么有机荧光团更好

超分辨率图像的最终分辨率取决于a)每个单个荧光团的定位精度(定位精度)和b)标记感兴趣结构的单个荧光团之间的最小距离(染色密度)。染色密度会受到影响,例如通过在免疫染色中使用更高的抗体浓度。定位精度取决于从单个荧光团收集的光子数,并且可以通过以下公式近似:

Δr:显微镜/物镜的衍射极限
N:单个定位的荧光团发出的光子数
Δ短信:单个荧光团的定位精度

因此,为了实现10 nm的定位精度,必须使用提供200 nm衍射极限分辨率的显微镜从荧光团中收集400个光子。首先发射的光子数是荧光团与包埋介质结合的特性。根据经验,有机荧光团比荧光蛋白具有更高的亮度和光稳定性。结果,这些染料传递的光子数量要高得多,并且定位精度也大大提高。最后,由于提高了定位精度,使用“更强”的染料(如有机荧光团)可以获得更好的超分辨率图像!

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