C. Elegans.
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用立体声和共聚焦显微镜有效地在发育生物学中工作:C.秀丽隐形

对于科学家,技术人员和教师在研究实验室或课堂上使用江苏体彩C.秀丽隐杆线,本报告旨在提供有用的信息,以帮助改善日常工作。目的是使江苏体彩拣选,转基因,RNA干扰,筛选和功能成像效率的工作步骤。它还详细介绍了装备研究江苏体彩实验室或生物学课堂/教学实验室的各种可能性解释江苏体彩方法。

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Introduction

蛔虫 Caenorhabditis elegans. 已被用作神经科学,发育和分子生物学的模型生物,遗传学超过40岁 [1]。它是第一种多细胞生物,使其整个基因组测序 [2] 并且,直到目前,是唯一的有机体,即神经系统中神经元连接图的唯一生物,是完全映射的 [3]。江苏体彩是一种抑制生物,具有遗传确定的细胞数,其在幼虫阶段结束时保持恒定,并且其神经系统含有302个神经元(神经细胞)。该江苏体彩用作神经发育,细胞分化,细胞凋亡(编程细胞死亡),老化等的研究中的模型生物体。大量基因 C. Elegans. 可以以类似的方式运作到哺乳动物的方法。大约1/3的基因 C. Elegans. 基因组与一些人类基因同源(衍生自共同祖先),结果使江苏体彩可用作对人类相关疾病研究的模型生物体。在实验室中培养江苏体彩很容易,快速培养,通常保持在室温以下(15-20 °C)。成年江苏体彩的长度约为1毫米,小于75 直径μm。它们保持在琼脂平板上,即培养皿内的琼脂凝胶,细菌 (大肠杆菌) as food.

C. Elegans的一般工作步骤

有几个常见的步骤,用于江苏体彩的常规实验室工作(图 1):

  1. 采摘江苏体彩 [4];
  2. a)转子 [5, 6]:将转基因微注射到江苏体彩中以改变其基因组;
    b)RNA干扰(RNAi) [7]:将双链(DS)RNA引入江苏体彩以抑制基因表达;
  3. 筛选:评估江苏体彩以检测成功的RNAi或转基因;
  4. 用各种方法研究分子生物学,生物化学,江苏体彩的遗传学;
  5. 江苏体彩的文档或功能性成像,通常用共聚焦或复合显微镜进行。

上面所示的工作步骤不一定以线性序列,即非线性“工作流”。首先,必须选择江苏体彩并“挑选”,接下来是对基因或蛋白质表达的操纵,然后在一段时间内繁殖江苏体彩。然后,江苏体彩通过表型(可观察特性)来区分,以找到具有追捧的特征的那些。如果这些江苏体彩中的少量太少,则可以重复先前的步骤。当存在足够数量的具有感兴趣的江苏体彩时,再次“挑选”,固定化,最后进行功能成像。

下面的照片(图2)显示了德国康斯坦茨大学分子微生物学部的典型江苏体彩实验室。

优化工作效率的关键考虑因素

优化工作效率取决于应用和使用,即实验室研究或教学在教室。

江苏体彩栽培和成像一般

培养,挑选,筛选江苏体彩等时有几点需要考虑:

  • 避免在改变琼脂板→同一金额的琼脂(相同高度)时重新焦点
  • 获得江苏体彩的清晰显微镜图像→琼脂上的细菌浓度(食物)
  • 减少江苏体彩成像板的荧光背景(自发荧光)→用薄琼脂层,没有蛋白胨 [4]
  • 必须与琼脂区分开江苏体彩→良好的对比度与传输的光很重要
  • 检测较弱的荧光信号以获得更好的图像结果→良好的荧光信号 - 噪声(S / N)比率和深色背景临界
  • 在较高总放大率下的成像江苏体彩时确保良好的对比度和高分辨率(以上60倍)

Worm picking

研究实验室

当挑选合适的江苏体彩并为遗传或生化分析准备它们时,通常使用立体声显微镜选择江苏体彩,并用小铂金属丝或睫毛挑选(图  3)。然后,对于通过江苏体彩的GONAD中的显微注射遗传修饰,将它们放在玻璃载玻片上的小,干琼脂垫上(图 3).

教室和教学实验室

教学需要不同的考虑因素而不是研究应用程序。需要降低污染显微镜光学器件的风险,抗琼脂或江苏体彩拣选器具需要减少。这 徕卡S6立体声显微镜 [8] 例如,提供方便的工作距离,高放大率和大景深,以帮助应对这些挑战并有效地工作。结合了 徕卡 LED2500照明 [9] (Figure 4) the Leica S6为课堂和教学实验室提供了良好的江苏体彩挑选解决方案。缺乏经验的学生往往更喜欢高分辨率的高度放大。因此,建议具有较高放大率的目镜,而不是更常见的目镜,而不是仅10倍。

江苏体彩筛选在Brightfield

徕卡微系统的几个立体显微镜系统可以实现更快的吞吐量的江苏体彩的高效筛选。 Leica S6例行立体声显微镜 [8]与LEICA LED2500轻型支架,或小照明子基(图5)对于江苏体彩筛选非常实用 [9]。当用1.6x前镜头配件操作时,它允许更高的放大率和分辨率。由于其紧凑的设计,S6也在实验室中占用了更少的空间。具有高对比度的江苏体彩图像,即使在低放大率下也可以用这些显微镜易于制成。他们是教学人员特别好的解决方案。

下表列出了使用Leica S6显微镜在使用Leica LED2500轻基底或子基板照明时与Leica S6显微镜在BrightField中江苏体彩筛选的不同优点。

优点比较:Leica S6的轻基底和子基板
徕卡LED2500轻基底徕卡照明子巴士
  • 通过足够的空间同时保持多个琼脂平板,使得一块琼脂板保持不足,从而最大限度地减少了一块空间
  • 做江苏体彩采摘,微注射等,有足够的地方为用户手在客观镜头下工作
  • 清洁学生课程的设置,因为没有外部灯,电缆,也可以脱落基地的设备
  • 由于居中的LED导致标本成像的良好对比甚至照明
  • 不使用时易于存储,因为整个显微镜设置易于适合壁橱架子
  • 强烈的图像对比:触发器和片面的黑暗场照明
  • 操作简单,为教学和培训是理想的
  • 小脚印:整个显微镜设置占据了桌子上的一个小空间

有效的江苏体彩筛选也可以通过 徕卡 M80立体声显微镜[10] 用一个 徕卡TL3000 ST Light Base (Figure 6) [11]。徕卡 M80具有普通的主要目标(CMO),因此没有倾斜的聚焦飞机,整个视野是双眼的尖锐焦点。此外,系统也是模块化的,允许您灵活地添加,交换或替换组件。如果需要同时由多个用户观察多个用户的样本图像,并且随着报告的高分辨率图像的记录,则可以安装数码相机。例如,一个 徕卡 MC 170/190 HD camera [12] 拥有5个或更多百万像素,产生高清(HD)Live和录制的图像。

转基因,微注射和RNAi

有几种方法可以改变江苏体彩的基因/蛋白表达。稳定和瞬态基因改性用微量注射进入江苏体彩进行。这两种主要方法是:转座子 [13],也称为跳跃基因,或CRISPR / CAS9 [14] 系统。具有CRISPR的转基因产率较低,需要一代循环,但转基因插入更稳定。转座子方法具有更高的产率,需要注射较少的江苏体彩,但在转基因整合到基因组中并不总是清楚的。

一旦将江苏体彩放入玻璃载玻片上的干燥琼脂垫上,就可以快速工作,否则江苏体彩可能会在过程中干燥和死亡。为了减慢江苏体彩的干燥,通常它被油覆盖,如卤代烃或石蜡 [6]。通常,显微注射应在少于5个 分钟。将带琼脂垫的滑块放置在倒置显微镜的阶段上,位于江苏体彩,并将转基因(DNA)注入远端性腺。

然后江苏体彩被恢复缓冲溶液覆盖 [6],用铂金属丝或睫毛挑选并放置在单个琼脂平板上,以进一步培养和繁殖。该工作步骤通常在具有差分干扰对比的手动倒复合显微镜上进行( DIC. [15] 或集成调制对比度(IMC)照明 [16] , 如那个 徕卡 DMi8 (Figure 7) or the 徕卡 DM IL LED [17]。强烈建议在显微镜下具有抗振设置,以获得更高的产量。

对于针头的精确定位用于显微注射,使用高精度,3轴,油气操纵器,例如来自Narishige仪器的实际。

RNA干扰(RNAi)用于改变翻译水平的蛋白质表达。通过用表达双链(DS)RNA的转基因细菌喂养江苏体彩来进行。江苏体彩摄取DSRNA,它进入所有江苏体彩的细胞(除神经元除外),它被细胞生物化学加工,然后产生短干扰(Si)RNA。曾经存在于细胞中,siRNA改变蛋白质表达。

转基因江苏体彩繁殖和荧光筛选

注射后,进一步培养江苏体彩,下一代用于实验。江苏体彩保持在20 °C进行传播。必须避免江苏体彩的干燥,因此琼脂板通常存储在塑料盒中。为了获得非常高的江苏体彩,Erlenmeyer烧瓶中的液体培养是第二种可能性。

大约五种江苏体彩足以进行蛋白质印迹分析(鉴定蛋白质) [18]。然而,差分梯度离心需要100,000个江苏体彩以通过密度分离细胞细胞器和蛋白质 [19].

因为转基因通常与绿色荧光蛋白组合( GFP. [20] 可以使用荧光立体显微镜选择它们。其他荧光标记如dsred [20] 可能在高表达水平毒性,所以通常 GFP. 是选择的标志。

必须使用BrightField和Rottermann对比度(大视野[FOV]),检查是否荧光信号,然后挑选另外的实验。对于成像,较年轻的江苏体彩通常优选,因为较旧的江苏体彩通常表现出更高的自发荧光,特别是在肠道中。将所选择的江苏体彩置于特殊的小琼脂平板上,没有蛋白胨和细菌以最小化自发荧光。琼脂层通常非常薄,以进一步降低自发荧光。

有效的荧光筛选江苏体彩可以用 徕卡 M165 FC [21] 或者 徕卡 MZ10 F [22] 荧光立体显微镜使用 徕卡 TL4000 RC [11] light base (Figure 8).

Advantages

  • 由于Leica M165的许多照明对比度可能性,江苏体彩的单个细胞很容易区分 FC/Leica TL4000 setup.
  • 快速切换高级文档和成像的对比度使得徕卡 M165 FC or Leica MZ10 F/Leica TL4000为用户组合非常实用和高效。
  • 由于具有Triplbeam技术的最高信噪比(S / N)比而强烈的荧光信号 [23] →激励和观察的单独光束路径。

一个视频 C. Elegans. 琼脂板上可以通过YouTube查看江苏体彩,只需单击下面的视频即可。仅检测来自荧光的发射光,没有使用其他照明(深色背景)。在视频中看到的大多数江苏体彩都在肠道上显示了一些自发荧光 [24]。只有一个江苏体彩是双阳性的,并且还显示出来自荧光蛋白麦克里的明亮信号 [20] 在它的咽部表达。视频被徕卡录制了 M205 使用徕卡的FA荧光立体显微镜 DMC4500数码相机。视频播放速度比原始录音速度略快,因此江苏体彩可能看起来比现实更快。

荧光筛选的重要考虑因素

  • 为了达到最高的对比度和分辨率,具有其复杂结构的透射光基座就像高放大率的光冷凝器一样。
  • 荧光成像的很少或没有背景光“噪声”由Leica TL碱产生
  • 使用Leica时,在高放大率上更好地对比度和更高的分辨率图像 TL4000 RCI [11] 基于其双面镜的凹面侧。
  • 在使用带有外部光源的Leica TL4000 RC基础时,避免加热江苏体彩。
  • 对于高自发荧光的情况,减少荧光激发强度将增加S / N比。在许多情况下,来自江苏体彩的荧光信号是最大的并且不能增加更多,但背景始终可以增加。
  • 根据个人用户的预算和要求,Leica TL3000 ST, Leica TL4000 BFDF [11],徕卡 TL4000 rc灯基础都可以使用。

Functional imaging

共聚焦和复合显微镜,如 徕卡 TCS SP8 或者 徕卡 TCS SPE confocal system [25] and the Leica DM6 or Leica DM2500直立复合显微镜 [26],通常用于江苏体彩的成像和记录,以获得亚细胞和大分子结构的高分辨率图像。

对于共聚焦成像,江苏体彩表达荧光蛋白,即 GFP. ,红色荧光蛋白(RFP,MCHERRY或DSRED),黄色荧光蛋白(YFP)或青色荧光蛋白(CFP) [20],如上所述(图9和10)。

具有直立配置的共聚焦显微镜是优选的,因为江苏体彩位于板中琼脂层的顶部。江苏体彩相对较快地移动,因此它们通常被药物左旋醇麻醉,然后将盖玻片放置在它们上方,以通过液体浸没目标观察。

幼虫阶段的幼虫可以对光线非常敏感,因此使用共聚焦共振扫描仪 [27],由于速度短,可以将光毒性的问题降低到最低限度。谐振扫描仪允许长期观察 C. Elegans. 幼虫没有明显的伤害。

图10:脑和神经系统的共焦图像(Leica SP2) C. Elegans. (从江苏体彩的腹侧查看)。神经元细胞表达荧光蛋白CFP, GFP. ,yfp和dsred,另外用白色的亲脂性跟踪染料染色。图像由H. Hutter,生物科学部,西蒙弗雷泽大学,Burnaby,BC,加拿大 [28].

总结和结论

常用方法 C. Elegans.  [29] 使用立体声,化合物或共聚焦显微镜涉及多个工作步骤。江苏体彩实验室的要求可以变化。若干配置和仪器可用于解决工作步骤中所做的特定任务。

以下是常用显微镜解决方案的列表:

  • 江苏体彩采摘经常用一颗大绿色立体声显微镜,例如徕卡 S6,使用产生高对比度的透射光基,例如,徕卡 TL3000 ST;
  • 用倒置的复合显微镜(例如Leica)实现转基因微注射 DMI8,使用微操纵器到定位针和用于DNA的注射器。此外,集成调制对比度是选择的照明方法;
  • 荧光筛选可以通过一系列荧光立体显微镜来完成,例如,徕卡 MZ10 F or Leica M165 FC,使用透射的光基础实现非常好的对比度,例如徕卡 TL4000 RC;
  • BrightField筛选通常用常见的主要目标(CMO)立体显微镜(例如Leica)进行 M80,具有高对比度的透射光底座,例如徕卡 TL4000 RC;
  • 功能成像,即转基因江苏体彩的表征,如细胞分化,细胞凋亡(编程细胞死亡),老化,神经元活动等,以直立化合物或共聚焦显微镜(例如Leica)进行 DM6 or Leica  TCS.  SP8;
  • 固定化的江苏体彩也可以以合理的分辨率成像,具有更高的性能荧光立体显微镜,例如徕卡 M205 FA,和透射光碱,例如透射光基 徕卡 TL5000 Ergo [11];
  • 对于图像江苏体彩胚胎,建议使用共焦谐振扫描仪以低光毒性;和
  • 对于教室,教学实验室和培训,显微镜设置要求可能因研究实验室而异。

此简短的报告可以是有用的参考或准则,当建立江苏体彩实验室并解释有效地执行必要的工作步骤所需的各种仪器。

Acknowledgements

我们要感谢Harald Hutter教授,生物科学部,Simon Fraser University,Burnaby,BC,加拿大,供应C.秀丽升杆菌大脑和神经系统的共焦形象。

References

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