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徕卡M205 FA记录的麻醉的地中海果蝇的荧光立体显微镜图像
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立体显微镜在发育生物学中更有效地工作:果蝇(果蝇)

果蝇 果蝇 一个多世纪以来,它一直是用于发展生物学研究的模式生物。它的基因组已完全测序,与疾病相关的基因与人的同源性很高。果蝇的常规工作流程包括使用立体显微镜的多个步骤。

该报告引用了果蝇科学家和技术人员的实例,并显示了各种显微镜和配件的不同可能设置。由于每个实验室的需求可能相差很大,因此可以使用大量的配置和仪器来解决工作流程中的特定任务,甚至可以使一个仪器执行更多的工作步骤。这份简短的报告根据不同的成熟果蝇实验室的经验介绍了推荐的工作流程,并且在建立或扩展果蝇实验室时可能是非常有用的参考或指南。

徕卡M205 FA记录的麻醉的地中海果蝇的荧光立体显微镜图像

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果蝇 一百多年来,它一直是遗传研究的典范生物,并在当今的遗传学,生理学,发病机制和进化领域继续广泛用于发展生物学研究 [1, 2]。大量护理相对容易且便宜。它繁殖快,产卵多,生命周期短,只有2周 [1, 2]。果蝇只有4对染色体 [3],其中许多很大,因此很容易找到突变 [4] and deletions [5]。它的整个基因组 [6]已被测序,许多突变可供使用。在两个基因组中发现的癌症和疾病相关基因的同源性 黑腹果蝇 人类是重要的 [7, 8].

对果蝇进行常规工作时,通常需要执行几个常见步骤 黑腹果蝇:

  1. “推蝇”,即通过立体显微镜观察可见标志物对蝇类进行基本分类,通常每天进行;
  2. 荧光筛查,类似于推蝇,但通常涉及用荧光体视显微镜观察胚胎或幼虫,以将成功转染的,表达基因的胚芽与未表达的胚芽分开;
  3. 通过体视显微镜进行解剖;
  4. 通常使用共聚焦或复合显微镜进行记录或成像,但也可以使用高性能立体显微镜。

为了清楚起见,在本文中,上面提到的常规果蝇工作的步骤顺序将称为“工作流程”(请参见图 1)。在许多情况下,工作流不是工作步骤的线性“流程”。

利用果蝇优化工作流程效率的关键注意事项

尝试开发更有效的工作流程时,必须考虑几个重要点:

  • 确定特定研究的关键任务,例如,使用可见标记或荧光蛋白标记对果蝇进行分选以进行选育;
  • 每个步骤所花费的时间和步骤的总数:通常,工作流程是每天重复,繁琐且耗时的工作,必须可靠,准确地完成工作,以保持所需的果蝇谱系;
  • 普通体视显微镜:具有良好的照明,分辨率和人体工程学方法,效率更高;
  • 样本特征:通常,蝇类和其他昆虫主要由多糖几丁质和各种蛋白质分子组成,这些蛋白质分子可导致自发荧光(来自样本的不需要的背景荧光信号) [9]并降低信噪比
    荧光显微镜观察时的(S / N)比;
  • 荧光立体显微镜:更快的工作流程,可以在滤光片之间以及荧光和明场之间快速切换,并且可以快速放大和缩小;
  • 解剖:灵活的照明和显微镜支架选项可提供符合人体工程学的工作流程;和
  • 文档/成像:记录突变表型,拍摄行为变化,测量解剖特征(如翅膀或腿的大小)以及细胞迁移的延时成像(通常用共聚焦显微镜进行)。立体显微镜的文档通常需要数码彩色相机的不同设置。

用于推蝇和荧光筛查的立体显微镜系统

飞推

推蝇是指按解剖特征和表型对蝇进行日常分类 [10]。苍蝇通常用一氧化碳麻醉2 放在CO上2 灌注垫进行分类。通常,使用立体显微镜进行分类。

徕卡微系统提供了几种类型的体视显微镜,通常可用于果蝇。 黑腹果蝇 用于推力,特别是Leica M50,Leica M60和 徕卡M80 CMO(通用主物镜)体视显微镜 [11].

这些显微镜提供的一些优势:

  • 光学器件具有极高的透光率,一眼就能看到很多细节,而无需使用可能会产生阴影或亮点的额外明亮照明;

  • 视野数(FN)为23毫米的目镜,可提供更大的视野(FOV)/物场(OF),为用户提供了在大面积垫上快速观察苍蝇的信息,从而实现快速,高效飞推(注意:Leica M80的FOV比Leica M50和Leica M60的小-请参见图 2);

  • 与Leica M60和Leica M50(最大NA为0.15)相比,Leica M80可获得更好的分辨率(最大数值孔径[NA]为0.206)。
  • 对于Leica M50和Leica M60较宽的FOV,根据应用场合,通常建议使用平场消色差物镜,而消色差镜头对于Leica M80足够了 [12, 13];
  • Leica M50,Leica M60和Leica M80可以配备 徕卡LED2000 要么 徕卡LED2500 多合一的显微镜支架和照明系统,使桌面的工作空间远离电缆和外部光源(注意:通常,果蝇被保存在数百个塑料小瓶中,这些小瓶充满了工作空间,有时设备的电缆可以被使用者撞到并意外将一些小瓶撞到地面上);
  • 诸如Leica ErgoWedges等用于立体显微镜的人体工程学配件可减轻重复工作的负担(注意:当实验室显微镜使用者整天用力推动苍蝇时感觉更舒适时,它们将提高生产效率,并且可以经济地改装人体工程学配件以适应较旧型号的徕卡显微镜);
  • 安装在支架上的紧凑型LED光源使立体显微镜易于移动以进行清洁,并为用户提供了更多的自由工作空间。

下面的照片显示了典型的 果蝇 带有用于推飞的立体显微镜的实验室(由奥地利维也纳大学神经生物学系T. Hummel提供)。

有用的信息(提示和技巧)

显微镜底板尺寸

显微镜占地面积是每个实验室的关键考虑因素。一氧化碳飞垫2 麻醉有不同的尺寸,但在推挤过程中都倾向于从显微镜底座上掉下来,因为底座可能太小。

解决此潜在问题的方法是:

  • 使用中等大小的基础;要么
  • 或者,可以使用小型摇臂(吊杆)支架,直接在长凳上工作(请参见图2)。 5). The 徕卡LED3000 带有鹅颈管的聚光灯照明(SLI)可以直接安装在摇臂架上,并且所有照明控件都可以直接从鹅颈管上使用,因此它们不会挤满长凳。

Greenough和CMO(通用主物镜)立体显微镜在推蝇方面的优缺点

Greenough的优势:

  • 通常工作距离比CMO体视显微镜更长;和
  • 经济解决方案。

Greenough的缺点:

  • 模块化程度有限;和
  • 透镜系统的光轴(每只眼睛)会聚到放置样本的中心点。每只眼睛的两个分开的焦平面不允许两只眼睛在远离中心的样品上清晰聚焦(请参阅图6)。

CMO的优势:

所有样品在两只眼睛都在同一焦平面上,与Greenough体视显微镜相比,在特定放大倍率下可获得更大的可用视场 [14, 15] and allows:

  • 概览更大,无需重新聚焦和移动飞垫;
  • 更快地识别果蝇;和
  • 更加顺畅的工作流程,使苍蝇推入过程不再那么繁琐。

图6比较了Greenough显微镜和CMO立体显微镜的光学器件。

荧光筛查

在许多实验室中,果蝇的特殊菌株已经改变了基因型 [16]表达绿色标记(绿色荧光蛋白),红色(RFP),青色(CFP)和黄色(YFP)荧光蛋白 [17, 18]。通常,观察蝇蝇幼虫或胚胎并用荧光立体显微镜分析,然后根据希望在预期器官中是否存在荧光标记物进行选择。使用荧光蛋白标记,例如 绿色荧光蛋白,使从突变幼虫进行非突变分类的工作变得更加容易。但是,为了收集足够的数据进行分析,必须筛选和分析许多果蝇幼虫。

徕卡微系统提供了几种类型的体视显微镜,可用于果蝇的荧光筛查: 徕卡M165 FC,徕卡M205 FA和 徕卡MZ10 F (请参见图中的示例图片 7).

每个显微镜可以为用户提供的一些优势如下:

徕卡M165 FC,M205 FA或MZ10 F荧光体视显微镜提供蝇蝇筛:

  • 独特的三光束设计,使荧光显微镜具有最佳的信噪比(S / N);
  • Leica M205 FA具有最佳分辨率(最大NA为0.349),其次是Leica M165 FC(最大NA为0.3),然后是Leica MZ10 F(最大NA为0.25);
  • 徕卡M165 FC和Leica M205 FA使用平场复消色差物镜,而消色差是Leica MZ10的典型物镜 F;
  • 徕卡M165 FC和Leica M205 FA具有编码的光学元件,可以可靠地测量苍蝇的解剖结构,例如腿,翼,眼睛等的尺寸和表面积;
  • 徕卡M205 FA具有FusionOptics技术 [19]通过目镜可以同时,甚至在高放大倍率下通过目镜获得视觉3D感知,这对于荧光屏非常实用;
  • Leica M205 FA是全自动荧光体视显微镜,因此,它还可用于复杂的成像,例如z叠加和多通道采集。和
  • 符合人体工程学的配件,例如Leica ErgoTubes,可通过调节目镜的高度和角度以减轻单个用户的舒适度,从而减轻重复工作的负担,从而提高生产率。

Dissection

进行果蝇及其幼虫的解剖,以便对器官和组织进行更详细的研究 [20]。通常,使用高性能体视显微镜进行解剖。

对于解剖果蝇和幼虫,通常使用Leica M80体视显微镜就足够了,但是Leica M125具有更高的放大倍率和分辨率和良好的视野,这使其更适合于制备苍蝇器官,例如大脑(请参阅图中的例子 8)。通常,稍后使用高分辨率共聚焦,复合或立体显微镜对器官成像。

文档/影像

通常使用编码的立体显微镜记录果蝇的眼睛,腿,身体和翅膀中突变的表型特征,通常是更高性能的系统,例如Leica M205 FA,Leica M165 FC,Leica M205 A,Leica M205 C ,Leica M165 FC,Leica或M165C。要拍摄用于观察果蝇行为的视频,请使用诸如 徕卡DMS1000 要么 徕卡DMS300 可能有用,可以在相对较小的设置下捕获高帧速率和较大的概览。此外,徕卡应用套件 X(LAS X)软件提供了扩展景深(EDOF)或图像z叠加等功能,可在3D模式下进行快速,常规的飞行表征。结合使用编码的Leica体视显微镜和 LAS X软件会正确校准所有图像,从而保证对机翼尺寸,腿长,眼表以及其他相关表型变化的准确测量。

对于许多研究,必须在亚细胞水平上对果蝇表型进行表征 [21]。通常使用共聚焦显微镜或复合显微镜(例如显微镜)对解剖的果蝇部分进行记录以获取亚细胞水平的细节。 徕卡TCS SP8 要么 徕卡TCS SPE (集中)或 徕卡DM6 (复合)。

Leica M205 FA经过完全编码和自动化,可以更轻松地完成复杂的成像任务。编码和自动化可在蜂窝和亚蜂窝级别提供可靠的测量。徕卡M205 FA使用FusionOptics技术 [19]和符合人体工程学的附件可供选择。

Conclusion

果蝇 果蝇 一个多世纪以来一直是用于发展生物学研究的模型生物 [1, 2]。它的基因组已完全测序,并且与疾病相关的基因与人的基因显示出相当的同源性 [7].

通常用于果蝇的常规工作流程 黑腹果蝇,涉及使用立体显微镜的多个步骤:

  • 飞蝇,苍蝇的日常基本分类;
  • 荧光筛查,观察胚胎或幼虫;和
  • 解剖,以备以后记录或成像。

通常用立体显微镜对果蝇的解剖结构或整个器官进行记录或成像,并用共聚焦或复合显微镜对它们进行解剖以获取亚细胞的细节。

本报告引用了与果蝇合作的科学家和技术人员的示例,例如 黑腹果蝇 并显示了各种显微镜和配件的不同可能设置。由于每个实验室的需求可能相差很大,因此可以使用大量的配置和仪器来解决工作流程中的特定任务,甚至可以使一个仪器执行更多的工作步骤。这份简短的报告根据不同的成熟果蝇实验室的经验介绍了推荐的工作流程,并且在建立或扩展果蝇实验室时可能是非常有用的参考或指南。

Acknowledgements

我们要感谢奥地利维也纳大学神经生物学系的Laura Geid和Thomas Hummel教授提供了果蝇实验室的照片,以及新加坡A * STAR IMB的Bruno Reversade教授。

References

  1. Manning G:快速简单地介绍了果蝇。果蝇虚拟图书馆。
  2. Morgan TH:传记– 1933年诺贝尔生理学或医学奖。诺贝尔基金会,瑞典斯德哥尔摩。
  3. 染色体。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
  4. 变异–遗传术语的词汇表。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
  5. 删除-遗传术语的术语表。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
  6. 基因组–遗传术语的词汇表。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
  7. Reiter LT,Potokii L,Chien S,Gribskov M和Bier E:果蝇中与人类疾病相关的基因序列的系统分析。基因组研究。 11(6):1114–25(2001); doi:10.1101 / gr.169101。
  8. Herrero J:如何获得两个物种之间的所有直系同源基因。合奏项目,英国剑桥。
  9. Hoff F:如何为免疫荧光显微镜准备标本。科学实验室。
  10. 表型–遗传术语的术语表。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
  11. Goeggel D:立体显微镜的历史–第三部分:19世纪–现代显微镜制造的突破。科学实验室。
  12. Goeggel D:立体显微镜的历史–第二部分:18世纪–对光学的需求更大。科学实验室。
  13. 目标类。徕卡显微系统公司。
  14. Rottermann R和Bauer P:清晰图像的形成方式:显微镜的景深。科学实验室。
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  16. 基因型–遗传术语的术语表。美国马里兰州贝塞斯达市国家卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究所(NHGRI)。
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  19. Goeggel D,SchuéA和Kiper D:FusionOptics –科学实验室将高分辨率和景深结合在一起,以获得理想的3D光学图像。
  20. Maimon I和Gilboa L:果蝇幼虫卵巢的解剖和染色。乔伊(Dove):10.3791 / 2537。
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