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立体显微镜在发育生物学方面更有效地工作:斑马鱼,Medaka和非洲爪蟾

在分子和发育生物学中使用的水生模型生物中,最突出的是斑马鱼(属: 里约热内卢  [1],或日本稻鱼(属种: 东方稻 [2]和非洲爪蛙(属:非洲爪蟾) [3]本报告旨在为科学家和技术人员提供有用的信息,通过使转基因,荧光筛查和功能成像的步骤更有效,可以帮助改善其日常实验室工作。

图:斑马鱼幼虫与myl7:AmCyan,lmo2:dsRED2,drl:EGFP和Rottermann对比

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主题 & 标签

上面提到的三种水生模型生物:斑马鱼,和 非洲爪蟾 常用于分子生物学和发育生物学。成年斑马鱼如下所示。

在分子和发育生物学中,这些水生脊椎动物模型生物被广泛应用于研究发育的分子过程和作为疾病模型。为了研究这些分子机制,对感兴趣的蛋白质进行了荧光标记,并在发育中的生物中数小时或数天在细胞或亚细胞水平上对其进行了观察。 [4].

此处描述的所有三种模式生物都可以在实验室中轻松繁殖和维护,生命周期短,并且易于进行基因修饰。这些修饰的例子是基因的缺失(敲除)或基因的导入(敲入)。如果将外源基因引入基因组,那么结果就是所谓的转基因生物。下面,我们将重点介绍这种方法 [5].

此外,斑马鱼具有特定的特征,也使其对发育神经科学有用:斑马鱼的幼虫是半透明的,因此在发育过程中可以同时测量多个神经元的活性 [6].

当代模型生物实验的关键考虑因素

对水生模型生物(例如斑马鱼)进行常规工作时,需要执行三个常见步骤:

  • 转基因
  • 荧光筛选
  • 功能成像。

以下部分将对每个工作步骤进行更详细的描述。这些都需要高效可靠的显微镜检查。此步骤顺序称为"workflow" in this report.

当用于科学实验时,大多数国家对动物安全有明确的规定。瑞士也有这样的规定 [7]。为了遵守这些规定,对转基因胚胎进行有效和快速的筛选以及对产生胚胎的成年斑马鱼进行快速处理是有利的。

由于不能单独标记成年斑马鱼,至少目前还不能永久性地标记,需要将杂种的雄性和雌性保存在单独的储罐中,以在筛选转基因时评估其胚胎,直到对它们的胚胎进行充分鉴定为止。可以更快地确定胚胎的特征:

  • 成人越早可以放回合适的储物箱中
  • 可以减少设施中单个储罐的数量以及工作人员的工作量
  • 而且只保留具有理想性状的斑马鱼,而无需为实验工作而保留不必要数量的鱼。

斑马鱼胚胎的更快,更准确的表征导致维护这些模型生物的更有效,更具成本效益的方式。

快速准确地鉴定胚胎有两个关键因素:

  • 有时发暗发光的转基因的高效荧光检测
  • 以及对胚胎成像以进行筛选的高效便捷的方法。

实际上,检测微弱的荧光信号并以简单的方式使其对眼睛可见的荧光显微镜是实现此目标的最佳工具。

Work steps

转基因

斑马鱼,和非洲爪蟾的遗传修饰通常通过DNA,RNA或染料(如质粒,mRNA,吗啉代,siRNA等)的显微注射进行。  [8]。立体显微镜(例如徕卡)可实现的光学放大倍率可有效支持这些操作 M50, Leica M60, or Leica M80 [9]。如果将DNA注射到细胞中并整合到基因组(转基因)中,则会产生转基因动物。

荧光筛查

随着生物体进入幼虫阶段,评估成功整合(进入基因组)和转基因的表达。转基因的一部分通常是荧光蛋白的基因,例如绿色,红色或黄色荧光蛋白 [10]。因此,潜在的转基因幼虫的筛选通常使用荧光体视显微镜,例如Leica MZ10 F [11]莱卡 M165 FC, or Leica M205 FA [12].

功能成像

功能成像的一个例子是通过Ca进行电生理检查 2+ 在各种类型的细胞中发出信号。用合成钙注射生物2+ 指标  [13],经常使用微操纵器,可以研究神经元和神经胶质细胞的神经元活动。由于发育中的斑马鱼幼虫具有半透明的性质,钙指示剂也可以在完整或半完整的生物中进行基因表达和成像。这些实验经常使用多光子荧光显微镜进行 [14].

在发育过程中,通常用体视显微镜对生物进行成像,在某些情况下,也要对其进行操作和准备进行进一步的实验。当仅需要2D视图时,可使用诸如Leica的宏观镜进行成像 Z6  APO 和徕卡  Z16  APO  [15]。用于高分辨率观察表达XFP的转基因(同时包含三个或更多荧光蛋白) [16] 生物或免疫染色的制剂,宏观显微镜或共聚焦,多光子和光片显微镜,例如Leica  TCS  SP8 series [17],是常用的。

斑马鱼实验室(Mosimann Lab,IMLS)的照片,其中显示了几台立体显微镜。

Key considerations for optimizing 工作流程 efficiency with aquatic model organisms

转基因

当产生转基因时,重要的是要使用透射光的碱基来可视化卵的内部结构。由于必须注射许多卵才能获得一些卵"founders"当转基因成功地整合到种系中时,注射通常需要几个小时,这使得放松的工作姿势非常重要。在注射步骤中,重要的是将鸡蛋放置在显微镜下,以便操作员有一个良好的视野,以快速有效的方式进行注射。最终,大型的显微镜底座使研究人员可以在多个培养皿之间移动,从而减少其掉落在边缘的风险。通常是微型操纵器,例如Leica操纵器 [18],Eppendorf InjectMan NI 2或Narishige MMO-220A。举几个例子,常用的注射器是ASI MPPI-3,Eppendorf FemtoJet和Parker Picospritzer。

用于转基因的常规手动体视显微镜

Leica 徕卡M50 M60, Leica M80 [8] 或Leica S8 APO [19] 徕卡立体显微镜 TL3000 ST or Leica TL5000 Ergo [20] 透射光基:

Increasing 工作流程 efficiency with the Leica 徕卡M50 M60, Leica M80, 和徕卡 S8 APO

  • 较大的视场(FOV)/物场(OF)(观察区域)→与FN为21或FN的目镜相比,可用场数(FN)为23的目镜的FOV增大了20%较小
  • 查看样品/样品时所需的聚焦较少→低倍放大时景深大;
  • 徕卡M80的最大分辨率为1.6μm(数值孔径(NA)为0.21),最大分辨率为2.2 μm (NA 0.15)与Leica M60和Leica M50;
  • 具有消色差或平面消色差物镜的高质量图像 [21];
  • 设计紧凑→占地面积小,可将显微镜安装在有限的空间内;
  • 提高舒适度和生产率:使用可调扭矩的聚焦驱动器时,肌肉拉力较小→根据显微镜系统的整体重量,可以根据用户的喜好调节聚焦旋钮的扭矩;
  • 避免因Ergo模块而感到疲劳→使用户在工作时保持更好的姿势;
  • 清洁紧凑的仪器总体设置→电缆集成到相机,照明和电动聚焦的聚焦柱中。

Increasing 工作流程 efficiency with the Leica TL3000 transmitted light base

  • 多种对比方法:明场和单侧暗场照明;
  • 在进行操作和分类时,以及在解剖期间,可以轻松地在目标周围移动多个样本/样本,并为双手更多的空间移动→要放置样本的平面较大;
  • 操作简单,非常适合常规应用。

Increasing 工作流程 efficiency with the Leica TL5000 尔戈 transmitted light base

  • 多种对比方法:非常均匀的明场,优化的Rottermann对比度和低反射暗场;
  • 易于操作,更快地工作并节省时间–自动光圈可根据变焦光学元件自动调整以实现最佳对比度;
  • 高精度研究整个生物–大视野(FOV)多达65个 mm diameter;
  • 在标本上无疲劳地工作,并且更容易操作机械手-极其平整,符合人体工程学的LED灯座;
  • 由于使用徕卡应用套件( LAS )和 LAS X软件  [22];
  • 借助最新的LED技术,可以实现与强度无关的明亮,均匀且颜色中性的照明。

荧光筛查

尽管荧光蛋白的生物工程已经产生了一些增强 绿色荧光蛋白 变体中,所需的转基因可能以低水平表达。这种低水平表达可能是由于生物学过程和技术问题造成的。由于这些原因,荧光检测的敏感性可以使发现和缺失正确表达转基因的转基因生物有所区别。此外,如上所述,有效,准确的斑马鱼胚胎性状表征对弱转基因信号进行有效的荧光检测非常重要。

在筛选和鉴定发育中的斑马鱼的过程中,通常需要比较具有相同照明和显微镜光学设置的生物。因此,必须存储这些设置以便于轻松,有效地调用并确保可重复性。了解转基因斑马鱼的荧光模式,孤立地看时可能非常抽象,通常需要在荧光和碱基的透射光之间切换。对显微镜控制器(例如Leica SmartTouch或脚踏板)进行编程,并与带有透射光底座的编码显微镜一起使用,例如带有Leica TL5000 尔戈的Leica M165 FC或Leica M205 FA,可以极大地简化此任务。它还可以在荧光成像后快速评估细胞位置和胚胎方向。

Autofluorescence

当在实验过程中观察到非常弱的荧光信号时,重要的是消除或尽量减少来自对动物进行成像的容器(通常是皮氏培养皿)材料的背景自发荧光。在经过多家商业供应商的广泛搜索之后,Mosimann实验室发现了塑料陪替氏培养皿,具有最小的自发荧光,足够坚硬的塑料,盖子闭合良好且价格优惠。这些陪替氏培养皿与特殊的制备步骤相结合以消除污染,可在实验观察过程中将背景自发荧光降至最低。有关这些培养皿的更多详细信息,可以从Mosimann实验室获得 [4].

常规手动体视显微镜用于荧光筛查

徕卡M125 [23] 带有荧光模块的体视显微镜(Leica EL6000 [24] 外部荧光源)或Leica MZ10 F [11] 徕卡荧光体视显微镜 TL3000 ST [20] 透射光基:

Increasing 工作流程 efficiency with the 徕卡MZ10 F

  • 高数值孔径(最大NA = 0.25)和10:1变焦范围,具有出色的分辨能力(最大1.33μm);
  • 采用TripleBeam技术的强荧光照明和最高的荧光信噪比(S / N) [25];
  • 平面消色差和复消色差物镜的高质量图像 [21];
  • 快速4位过滤器更换系统(FLUOIII);
  • 适用于几乎所有荧光技术的多种标准和定制滤光片;
  • 用户防护 紫外线 辐射暴露;
  • 提供多种物镜和配件

研究荧光体视显微镜用于荧光

Leica M165 FC荧光体视显微镜(中档),配备Leica TL4000 RC / RCI透射光底座和M205 FA [12] 配有Leica TL4000 RC / RCI或Leica TL5000 尔戈的荧光体视显微镜(高端) [20].

Increasing 工作流程 efficiency with the Leica M165 FC and M205 FA

  • 变焦光学放大倍率范围为16.5:1或20.5:1,从概述到最细致的细节;
  • TripleBeam具有最高的荧光信噪比(S / N) [25] 技术;
  • 徕卡M165 FC分辨率低至1.10μm(最大NA 0.3),徕卡M205 FA分辨率低至0.96μm(最大NA 0.w35);
  • 在立体显微镜下观看3D图像可获得目前可能的最高分辨率和景深→FusionOptics [26] 可与Leica M205 FA一起使用;
  • 具有平场消色差或平场消色差物镜的高质量图像 [21];
  • 仪器编码可轻松获得可重复的结果;
  • 使用Leica PLAN观察沉浸或嵌入样品的无失真 APO 2.0倍CORR物镜,可消除折射率失配 [27];
  • 使用全自动Leica M205 FA进行复杂的实验时,完全的舒适性和易用性;
  • 快速4位过滤器更换系统(FLUOIII);
  • 适用于几乎所有荧光技术的多种标准和定制滤光片;
  • 提供多种物镜和配件。

Functional imaging

功能成像通常涉及电生理研究和神经元活动的研究,以实验方式利用钙2+ 信号或生物体解剖。由于斑马鱼幼虫的半透明性质,这类实验通常使用多光子荧光显微镜进行  [6,  14] 或共聚焦显微镜 [17]。对于解剖,成像通常使用体视显微镜进行。功能成像的一些示例如下所示。

总结和结论

斑马鱼 (达尼奥·里奥)  [1] ,鱼 (Oryzias latipes)[2]和非洲爪蛙 (非洲爪蟾)[3] 是通常用于发育生物学研究的水生模型生物。

The routine 工作流程 for zebrafish, medaka fish, or african clawed frog involves multiple steps using stereo microscopy:

  • 转基因,将DNA注入生物体的卵中以产生"founders";
  • 荧光筛查,观察幼虫是否正确转基因表达以寻找“创始人”
  • 功能成像,以较低或较高分辨率的显微镜表征稳定的转基因品系,或研究电生理和神经元活性。

转基因通常是通过体视显微镜进行的,而转基因品系是通过荧光体视显微镜进行的。为了获得更高分辨率的成像以获得亚细胞细节,电生理或神经元活动,使用了共聚焦或复合显微镜。

该报告引用了从事水生模型生物研究的科学家和技术人员的实例,并显示了各种显微镜和配件的不同可能设置。由于每个实验室的需求可能相差很大,因此可以使用大量的配置和仪器来解决工作流程中的特定任务,甚至可以使一个仪器执行更多的工作步骤。这份简短的报告根据不同实验室的经验介绍了推荐的工作流程,在使用斑马鱼,鱼或非洲小爪蛙建立或扩展发育生物学实验室时,可以作为非常有用的参考或指南。

References

  1. 里约热内卢 ,网站链接:www.FishBase.org
  2. 东方稻,网站链接:www.FishBase.org
  3. 非洲爪蟾,网站链接:www.amphibiaweb.org
  4. 瑞士苏黎世大学分子生命科学研究所(IMLS)莫西曼实验室
  5. 模范生物体,维基百科,N.B.特别参考本页列出的有关斑马鱼和非洲爪蟾的参考书85-87
  6. Borlinghaus RT:神经科学与显微技术:奖励合作伙伴关系,网站链接:科学实验室
  7. 瑞士联邦食品安全和兽医局(FSVO),动物实验,网站链接:www.blv.admin.ch
  8. DNA,维基百科; RNA,维基百科
  9. 手册,Leica M50,M60,M80
  10. Greb C:荧光蛋白–简介和光谱特征,网站链接:科学实验室
  11. 手册,徕卡MZ10 F
  12. 手册,Leica M165 FC,M205 FA
  13. 钙成像,维基百科
  14. Pfeifer A:用于深层组织成像的多光子显微镜原理,网站链接:科学实验室
  15. 手册,Leica Z6 APO ,Z16 APO
  16. Livet J,Weissman TA,Kang H,RW草稿,Lu J,Bennis RA,Sanes JR和Lichtman JW:在神经系统中荧光蛋白组合表达的转基因策略,网站链接:www.nature.com,Nature 450:56 –62(2007年11月)
  17. Leica TCS SP8产品页面
  18. 徕卡显微机械手产品页面
  19. 徕卡S8 APO 手册
  20. 手册,Leica TL3000,TL4000,TL5000
  21. 物镜分类,徕卡产品页面
  22. 手册,Leica LAS X软件
  23. 手册,Leica M125,M165 C,M205 A& C
  24. Leica EL 6000产品页面
  25. Fuchs B:采用TripleBeam技术的立体显微镜第三条照明路径可在荧光显微镜中提供更好的信噪比,网址:科学实验室
  26. Goeggel D,SchuéA和Kiper D:FusionOptics –结合高分辨率和景深以获得理想的3D光学图像,网址:科学实验室
  27. DeRose JA和BürgersH:如何通过使用正确的物镜消除液体浸入或嵌入的样品/样品的折射率不匹配,来校正立体显微镜的像差,网站链接:科学实验室