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工作流程&协议:神经科学中的连接显微镜和分子生物学

在巴西举行的Leica LMD用户研讨会的报告

在第二次徕卡激光显微切割中(LMD)在巴西举办的研讨会,由 巴拉那联邦大学(UFPR) 由Leica Microsystems产品经理Falk Schlaudraff博士持有 LMD 系统已引入新用户。此外, 第一个LMD车间农业核能中心/ USP(CENA) 可以 加深他们对激光显微切割的了解。

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本课程的主要主题是如何在神经科学中应用激光显微解剖。徕卡专家展示了为什么激光显微解剖技术是一种适合大脑研究的技术,因为它可以分离不同的大脑层甚至分离出单个神经元。

在简要介绍了激光显微切割的世界之后,介绍了各种选择,不同的应用,技巧&技巧,与会者有机会自己操作该系统。此外,Leica Microsystems还提供了有关不同样品制备技术的培训。

每个参与的科学家都有机会测试和验证整个 工作流程 在便宜的标准PCR管中,从天然样品到所需的目标纯目标细胞。

图2:在用Leica LMD7000系统分离黑质之前(左)和后(右)的鼠中脑切片(未染色,60 µm)的样品概述。

除了训练不同的样本制备技术外,一些科学家还带来了自己的样本进行解剖。一个任务是从未染色的小鼠大脑中收集整个黑质(图2)。

"在评估了其他一些系统之后,参与者对数据库的强大功能感到惊讶 徕卡LMD系统," Falk said. "我们的激光仪可以通过速度和选项来收集覆盖多个视场的大面积区域,从而可以一次切割70 µm的未染色部分。这样,可以在极短的时间内从所有提供的样本中收集所需的大脑区域。如此大的激光显微切割区域,未染色且边界清晰的大脑层,是蛋白质组学和代谢组学的理想起始材料。"

第二项任务是解剖单个细胞-而不是收集整个大脑区域(如黑质)或较小区域(如海马层)。无论是大面积任务还是单个单元格,都可以轻松完成 徕卡LMD系统 通过标记目标或直接用激光解剖它。小组同意这两种方法都有其优势。

标记材料可以进行校正,显示信息,例如标记的目标区域尺寸为µm²,并将目标委派给一个或多个收集器。"剖析实况,无需先画线-这对于 徕卡LMD系统 –非常快,也很有趣," Falk stated.

实时应用Move + Cut可通过重新解剖具有挑战性的组织部位或恢复未完全解剖的区域来与图形结合。

图3:单细胞收集示例。左:标记单个神经元进行解剖。中心:解剖神经元后的相同区域(均为:63x物镜,小鼠大脑切片10 µm,用甲酚紫染色)。右图:可以使用4倍物镜在收集帽中快速查看七个收集到的细胞。

解剖靶细胞,单个细胞或更大区域的快速且易于学习的方法,不受它们在玻片上的大小,形状,数量和分布的影响,突显了其灵活性 徕卡LMD系统 适用于各种应用。研讨会结束后,所有参与者都可以在数分钟内为自己的任务运行该系统,并感到很舒服地收集目标。

除了手动进行激光显微切割外,还引入了Leica AVC模块(模式识别)。该模块有助于加快收集单个细胞的过程,并要求与系统的交互最少。

在样品制备车间中,准备了小鼠的多个器官进行解剖。这些样品需要特殊的操作规程,以保留分子含量而不会产生负面影响,因为将在激光显微切割后对其进行研究。

鼠脑切片固定和甲酚紫染色的实验步骤简介[1]:

  1. 确保清洁(例如无RNAse)和无菌工作条件。
  2. 将低温恒温器冷却至-35°C。
  3. 重新准备整个大脑,以备不时之需。
  4. 将大脑放在低温恒温器的固定装置上 华侨城.
  5. 在-35°C的低温恒温器中使大脑平衡1小时。
  6. 在-19°C平衡大脑45分钟。
  7. 调整低温恒温器以进行适当的切割。
  8. 切开大脑(50 µm切片)以在感兴趣区域附近获得平坦的表面。
  9. 切一些10 µm的切片(如果切片滚动,降低温度并再次平衡15分钟,如果切片破裂,请升高温度并再次平衡15分钟)
  10. 准备一个或多个扁平部分以进行安装(如果需要,请使用刷子拉伸这些部分)。
  11. 使用室温下的膜片并将膜的一面小心地放在冰冻部分的顶部(该部分会融化到膜上)。
  12. 将装有固定部分的玻片放入装有5%EtOH的50​​ ml Falcon管中,在-20°C下放置2分钟(应准备75%的EtOH,并在-20°C下过夜保存)。
  13. 将玻片浸入含有1%甲苯磺酰紫的75%乙醇的50 ml Falcon中1分钟
  14. 将玻片浸入(约4秒)上升的EtOH行:75%EtOH,90%EtOH和最终100%EtOH,将其在100%放置30-60秒。
  15. 在装有圆锥形硅胶袋的50 ml Falcon管中将玻片干燥至少20分钟。

尽管此过程很简单,但其他类型的组织(例如植物)可能更棘手,甚至更容易解剖。这将是下一篇文章的主题。