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工作流程&规程:如何用激光显微切割分离单个染色体

在巴西举行的Leica LMD用户研讨会的报告

在巴西举行的第一届徕卡讲习班期间, 农业核能中心/ USP(CENA) 参与者学习了如何准备用于激光显微切割的样品 (LMD) 使用冷冻切片机。另一个主题是从染色体扩散中解剖单个染色体。

徕卡专家与 LMD。之后,新 LMD 用户能够运行该系统并练习如何解剖染色体并收集单个染色体以进行下游分析。

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使用冷冻切片机制备LMD的样品

与常规显微镜相比,激光显微切割的标本制备更加棘手:需要保护组织的内容,以免其降解和改变。此外,所用的固定剂和污渍不应影响或影响下游分析。因此,新鲜的冷冻组织是尤其是RNA下游分析的首选:新鲜的材料提供了最高的起始质量和特殊的固定方案。染色程序将在整个上游过程和整个过程中保持较高的RNA质量。 紫外线激光显微切割过程对RNA质量没有影响 也一样

图1:2:Leica Microsystems产品经理Falk Schlaudraff博士(中间,左)解释了如何使用Leica冷冻切片机对新鲜冷冻组织进行激光显微切割样品制备。

LMD的染色体传播准备

除了用于RNA下游分析的组织准备和解剖外,还需要DNA分析(例如用于突变检测)。由于单个细胞通常包含两对染色体,因此分离单个染色体对于特定于染色体的疾病以及理解基因结构和基因在不同物种中的贡献尤其重要。

随着 徕卡LMD系统 与150x干燥物镜结合POL框架载玻片,单个染色体分离非常容易。步骤1:需要准备在POL框架玻片上扩散的染色体。徕卡 LMD 方案指南提供了从人血中制备白细胞样品的方案(由荷兰拉德布德大学奈梅亨医学中心病理学系亨利·迪克曼博士提供)。

激光显微切割的染色体扩散准备的操作步骤:

  1. 将细胞培养72至96小时。
  2. 用秋水仙胶处理培养物1小时。
  3. 用低渗溶液处理培养物10-12分钟。
  4. 洗涤步骤和细胞固定在甲醇/乙酸(3 + 1,v / v)中。
  5. 将固定的细胞滴在POL FrameSlide上,风干过夜。
  6. 吉姆萨染色溶液施加3分钟。
  7. 在水中另一个洗涤步骤后,将载玻片风干。
  8. 幻灯片被安装到徕卡 LMD 系统,并创建了低放大倍率的标本概览,以便于识别色差。
  9. 150x物镜用于点差的详细可视化。
  10. 清洁目标染色体的周围区域(“移动+剪切”或“绘制+扫描”模式)。
  11. 选择感兴趣的染色体的收集设备,并用合适的激光设置进行解剖。

这个短片展示了一个新的 LMD 在Leica专家的指导下练习如何解剖染色体的用户:

棘手的工作是在收集单个染色体后开始的,因为分析和扩增这种少量物质并不容易。但是,诸如Qiagen Repli-G套件之类的商业套件可以帮助应对这一挑战。"正如在这次活动中所证明的那样,染色体本身的收集是可行的,而且易于学习,"  Falk says. "另外与徕卡合作 LMD 该系统很有趣,因为它提供的功能远远超过看幻灯片。"

徕卡 LMD 系统是显微镜和分子生物学之间的联系。"找到适合您系统的正确设置后,就可以开始了," Falk explains. "值得花费时间为样品找到最佳设置,因为您可以轻松地存储和恢复这些设置,从而使您的生活更加轻松,并节省宝贵的时间以获得更大的成功!"