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Workflows &协议:如何使用Leica激光微生物系统和Qiagen试剂盒进行成功的RNA分析

激光微粉(LMD) 允许分离单个细胞或染色体,并且是通过PCR或测序技术在下游分析之前的样品制备的良好的方法。在这里,我们描述了成功的组合 Leica LMD system QIAGEN试剂盒均匀纯化核酸。提出 工作流程 和协议为成功提供了基础 LMD. 应用没有任何核酸量丧失并保留在加强产品的高质量的过程中的RNA完整性。

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材料 - 实验室库存

徕卡LMD系统

  • 低温恒温器(例如Leica Cm1850 紫外线 )
  • 管液管10-1,000μl.
  • 管液2-20μl.
  • 管子离心机
  • 镊子和刷子的低温恒温器

材料 - 化学品和耗材

Qiagen Rneasy Micro套件

  • 一袋50毫升猎鹰管
  • 纯乙醇(EtOH),分子生物学等级
  • 分子生物学级水
  • 芝麻紫罗兰色
  • 铝箔
  • 0.5或0.2毫升薄壁PCR管,平面盖适用于 LMD. 舞台收集持有人
  • 移液尖端(1 ml移液管和20μL移液管)
  • 注射器与无菌过滤器尖端
  • 冷冻机的刀片
  • parafilm.
  • 徕卡 LMD. 幻灯片(例如4μm笔框架)
  • 硅胶袋
  • 金貂

Preparation upstream

1 %番茄紫(CV)解决方案100 %乙醇(EtOH):将500毫克酸甲基紫粉加入50 ML Falcon Tube并加100 % EtOH to fill 50 ml。应该准备1 使用前一周。将Falcon放入冰箱中,用铝箔盖上盖子(芝紫罗兰是光敏的),每天都会摇匀。

Etoh Row用于固定和洗涤步骤:

  • 2次75. % EtOH: fill 37.5 ml EtOH into 50 ML Falcon Tube并将分子生物学级水添加至50 ml
  • 将一个75%Etoh Falcon放入-20 °C freezer
  • 95 % EtOH 47.5 ml EtOH into 50 ML Falcon Tube并将分子生物学级水添加至50 ml
  • 100. %EtOH 50ml EtOH成50 ml Falcon tube
  • Falcon管中的乙醇行可以(重新)最多3 days.

重要的提示:

  • 用Parafilm密封猎鹰储存→这将防止Etoh蒸发!
  • 地方 LMD. 滑动10分钟 紫外线 -C灯→激活膜,以便更好地粘附并灭菌表面!
  • 将0.2或0.5毫升管在盖子下打开 紫外线 -c灯至少30 Min→消毒并消除任何RNA& RNase!
  • 用锥形中的一些二氧化硅袋准备三个50毫升猎鹰管→二氧化硅将保持滑块和段干燥,使用RNA表示湿度和水分是您的敌人,因为他们可以激活RNASE!

Cryosectioning

将块与冷冻块放入Leica Cryostat直接从-80 °C并让它平衡至少30 min at –19 °C.

均匀厚度的平衡准备部分(应根据感兴趣的细胞的直径选择厚度,为此测试10 制备μm部分)。

将一个(卷曲的)部分直接从Cryo进入0.5 ML管并立即添加350 μlrlt缓冲液(qiagen的含量 Micro RNeasy 成套工具)。这将作为质量和数量的积极控制。

图4:用冷镊子收集的卷曲部分,直接转移到无菌管帽。 350. 立即加入μLRLT缓冲液以保护RNA免于降解。

图5:剖面准备和安装在笔框架上。冷冻部分将容易地熔化到来自室温的膜。

将幻灯片与部分放入猎鹰,75 %eTOH溶液在-20 °C for 2 分钟(简要固定)。在2之后 分钟短暂地空气干燥滑动并将其存放在50 ML Falcon与锥形中的一些二氧化硅袋(保持干燥)。

用另一个部分重复此安装,但幻灯片,而不是存储添加一些1 用无菌过滤器尖端用注射器%番糖基紫溶液。将染色解决方案留在1个部分上 闵。然后,通过将载玻片短暂浸入75的液体通过浸入75时从芝麻螺旋中洗掉 % EtOH, then 95 %Etoh,最后100 %EtOH。将滑块短暂喷气,并将其存放在50 ML Falcon与锥形中的一些二氧化硅袋(保持干燥)。

用另一个部分重复整个过程并幻灯片。

图。图6:甲苯基紫通过无菌过滤器涂上注射器,覆盖滑块上的部分1 min.

图7:染色后的洗涤步骤:将载玻片浸入上行EtOH排中以洗掉剩余的酸紫罗兰色。

重要的提示:

  • 在鹿头中储存在Falcon管中的幻灯片,在康塞中有一些二氧化硅袋,用parafilm封装那些→二氧化硅将保持滑动和段干燥,密封保护环境水分!

将所有管和猎鹰存放在冰上滑梯。让幻灯片平衡为15 在室温下的分钟 LMD. 在使用前密封猎鹰的系统。

LMD test slides

你现在应该有:

  • 1个截面,管中具有350μlrlt缓冲液(阳性对照)
  • 1段安装在滑块上并用etoh固定在50中 ML Falcon与硅胶袋
  • 2载有安装的部分,用EtOH固定并用CV染色,储存在50中 ML Falcon与硅胶袋

图8:缓冲,管,猎鹰中的滑块和75 从冰上冰箱的%EtOH。

使用未染色部分的滑块用作另一个控制。因此直接用RLT缓冲液从膜中消化它并将其转移到0.5中 ML管(RLT缓冲液的总量必须为350 μl,不要使用它的所有物质从幻灯片中消化,因为它会冲洗幻灯片!)。

其中一个固定和染色的载玻片用作另一个控制。因此,直接用RLT缓冲液从膜中消化部分并将其转移到0.5ml管中(RLT缓冲液的总量必须为350 μl,不要使用它的所有物质从幻灯片中消化,因为它会冲洗幻灯片!)。

Leica LMD系统RNA分析

施加剩余的固定和染色的幻灯片 LMD.。因此,在样品架中加载滑块并加载0.5 收集持有人的ml管。选择加载的收集器的位置,并将整个部分标记以进行解剖 LMD. 软件,使用所需的放大率。在解剖后开始激光并检查,所有部分都已收集在收集管中。如有必要,请使用Move + Cut重新剖面,以确保收集所有部分。

Unload the collection tube, carefully close the lid and briefly spin down the dissectates. Open the lid and add 350 μlrlt缓冲液(最多65 在切割之前,可以将μlrlt缓冲液添加到收集帽中)。

图9:装有固定和染色部分的笔框架滑动 LMD. system.

装载另一个集合盖,并将空膜靠近收集部分的区域(大致相同的区域大小为μm²)。卸下收集管,小心地关闭盖子并简要旋转解剖。打开盖子并加350 μlrlt缓冲液(最多65  该管将作为一个 LMD. 稍后的负面控制。

图。图10:将切片以所选择的倍率分解成无菌管帽。

图11:显着的区域和解剖结果很容易可视化:左=切割线,中心=解剖区域,右=在收集管帽中解剖。

重要的提示:

  • 最多65μlrlt缓冲液可以直接施加到收集管帽上,以保护解剖含量直接在捕获后免于降解

图。图12也可以用肉眼(使用5x目标实现的解剖)在低倍率下收集的解剖。

激光微粉下游的制备和处理

  • 使用RPE将44毫升添加到瓶子上,然后选中复选框以确保添加ETOH。
  • 准备70个解决方案 % EtOH: add 35 ml 100 % EtOH to a 50 ml Falcon and add 15 ML分子生物学级水。
  • 准备80个解决方案 % EtOH: add 40 ml 100 % EtOH to a 50 ml Falcon and add 10 ML分子生物学级水。

图13:使用QIAGENRNEAY的RNA提取的轻微修饰方案® 微 kit was used.

用QIAGEN MICRO KIT提取RNA,具有以下略微改性方案:

  1. 让所有管准备好。

  1. 将350μL70%EtOH加入每个管(如有必要,在加入350之前转移到另一个合适的体积管中 µl 70 %EtOH),小心地混合吸管并直接转移到红色旋转柱。

重要的提示:

350μl应分成100和250μl,以免超过0.5的体积 ml管。混合可以直接在柱上完成。

  1. 旋转15秒,以10,000 rpm。

图14:缓冲液应用于QIAGENRNEASY® spin column.

  1. 丢弃流通并加入350μlrw1洗涤柱
  2. 旋转15秒,以10,000 rpm。

图15:准备好的离心机中的列。

  1. 丢弃流通,将柱子放入新鲜的2毫升管中并加500 μlrpe(etoh以前加入)洗涤柱
  2. 旋转15秒,以10,000 rpm。
  3. 丢弃流通并加500 µl 80 %EtOH洗涤柱
  4. 旋转2分钟,13,000 rpm
  5. 丢弃流动并将柱子放入新鲜的2 ml tube
  6. 最大5分钟。速度和盖子打开以干燥柱的硅胶膜
  7. 在14μl水中洗脱:小心牵引14 无RNase的水进入塔膜的中间,并将柱子放入新鲜并标记的1.5 ml tube

图16:14μL无RNA酶的水轻轻地施加到塔的中间中以供萃取的RNA。

  1. 旋转1分钟,13,000 rpm
  2. 小心地将流入流返回到柱膜的中间
  3. 旋转2分钟,13,000 rpm

洗脱液应储存在-80 °C或如果可能的话,立即用于评估质量和数量。

简短的协议摘要

样品:

A - 样品直接从Cryo(总体阳性控制)挑选
B - 样品固定,用液管挑选(阳性控制,EtOH固定的效果)
C - 样品固定并染色,用液管挑选(阳性控制,EtOH固定和染色的效果)
D - 样品固定并染色,收集 LMD. (效果 LMD.)
在样品旁边收集的E - 空膜(阴性控制 LMD. 过程/污染物)
F - RLT缓冲液下游净化的阴性控制

用Qiagen Micro Kit提取RNA:

  1. 添加350μlrlt缓冲液
  2. 加350μl70 %EtOH,用液管混合并直接转移到柱子
  3. 旋转15秒,10,000 rpm
  4. 丢弃流通并用350μlrw1洗涤
  5. 旋转15秒,10,000 rpm
  6. 丢弃流通并用500μL的RPE洗涤(之前加入EtOH)
  7. 旋转15秒,10,000 rpm
  8. 丢弃流通并用500μl80%EtOH洗涤
  9. 旋转2分钟,10,000 rpm
  10. 丢弃流动
  11. 旋转2分钟,最大。盖子的速度向干燥的膜开放
  12. 在14μl水中洗脱*
  13. 旋转1分钟,全速
  14. 使用洗脱液并将其放回柱中
  15. 旋转1分钟,全速

Results

好吧®28s / 18s.
(高度)
28s / 18s.
(区域)
浓。
(ng /μl)
样本
描述
警报观察总RNA区域RRNA地区
A0137梯子
A17.41.41.969.1A2.790.61
B17.11.31.984.5B3.410.76
C17.31.42.0127C5.131.26
D17.21.02.083.6D3.380.78
E16.50.40.4110E4.440.98
D96.90.70.967.3D2.680.59
C27.36K!RNA.浓度外面的rine推荐范围0.30
D26.57L!RNA.浓度外面的rine推荐范围0.27
样本名称材料日期时间A260浓度(NG / UL)A260(10毫米)A280(10毫米)A260 / A280A260 / A230
Blank_6.RNA.11.12.2014######000
ARNA.11.12.2014######32.420.810.411.980.13
BRNA.11.12.2014######48.181.20.582.070.1
CRNA.11.12.2014######71.011.780.8921.51
DRNA.11.12.2014######48.321.210.542.240.03
ERNA.11.12.2014######64.651.620.732.20.06
DRNA.10.12.2014######41.791.040.472.230.03
KRNA.11.12.2014######1.720.040.021.970.02
LRNA.11.12.2014######0.740.020.012.910.02

Quality

具有不同治疗的所有样品(A-D)具有几乎相同的质量(RIN 7.1-7.4)。对EtOH固定,染色和徕卡没有影响 LMD. 解剖检测。

在Parafilm密封50中的滑块储存 ml Falcon tube at–80 °C过夜,轻轻地解冻了20 min in –20 °C freezer, 20 min in 4 °C fridge and 15 在重新打开Falcon管之前的室温下最小导致徕卡后的结果 LMD. 解剖(样本E1&D9,RIN 6.9和6.5)。

所有阴性对照都是空的。

Quantity

具有不同处理的所有样品(A-D)几乎相同,仅量C(固定,直接从载玻片染色并拾取)显示出比阳性对照(样品A)的量更高。没有EtOH固定,染色或徕卡的影响 LMD. 解剖检测。

在Parafilm密封50中的滑块储存 ml猎鹰管在-80 °C过夜,轻轻地解冻了20 min in –20 °C freezer, 20 min in 4 °C fridge and 15 在重新打开Falcon管之前的室温下最小导致徕卡后的结果 LMD. 解剖同样(样品E1和D9,储存后的量略高)。

所有阴性对照都是空的。

不同的测量方法导致不同的结果→测量的常见不准确。

总而言之,这些数据清楚地表明工作流程不会影响RNA质量或数量。

Acknowledgement

我想要感谢 Randolph-Habecker博士 举办举办 LMD. workshop.

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