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工作流程& Protocols: How to Use a 徕卡 Laser 微dissection System and Qiagen Kits for Successful 核糖核酸 Analysis

Laser 微dissection (LMD) 允许分离单个细胞或染色体,并且是在通过PCR或测序技术进行核酸含量下游分析之前用于样品制备的成熟技术。在这里,我们描述了 徕卡 LMD 系统 和Qiagen试剂盒,用于从少量核酸中纯化核酸。提出了 工作流程 和协议为成功提供了基础 LMD 应用过程中不会丢失任何核酸数量,并在整个过程中保持RNA完整性,这突出了产品的高质量。

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材料–实验室库存

徕卡 LMD系统

  • 低温恒温器(例如Leica CM1850 紫外线)
  • 移液器10–1,000 µl
  • 移液器2–20 µl
  • 离心管
  • 低温恒温器用镊子和刷子

材料–化学药品和消耗品

Qiagen RNeasy 微 kit

  • A bag of 50 毫升猎鹰管s
  • 纯乙醇(EtOH),分子生物学等级
  • 分子生物学级水
  • 甲酚紫
  • 铝箔
  • 0.5或0.2 ml带有平盖的薄壁PCR管,适用于 LMD 舞台收藏夹
  • 移液器吸头(用于1 ml移液器和20 µl移液器)
  • 带无菌过滤嘴的注射器
  • 冷冻切片机刀片
  • 封口膜
  • 徕卡 LMD 幻灯片(例如4 µm PEN框架)
  • 硅胶袋
  • Kimwipes

Preparation upstream

1 100中的%甲酚紫(CV)溶液 %乙醇(EtOH):将500毫克的甲酚紫粉加到50毫升中 毫升猎鹰管,并添加100 % EtOH to fill 50 毫升应准备1 使用前一周。将猎鹰放入冰箱,盖上铝箔(对​​甲苯酚紫敏感),每天轻轻摇动。

EtOH行用于固定和清洗步骤:

  • 2倍75 % EtOH: fill 37.5 ml EtOH into 50 ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50 ml
  • 将一只75%EtOH猎鹰放入–20 °C freezer
  • 95 % EtOH 47.5 ml EtOH into 50 ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50 ml
  • 100 % EtOH 50 毫升乙醇到50  ml Falcon tube
  • 猎鹰管中的乙醇行最多可重复使用3次 days.

重要的提示:

  • 用Parafilm密封猎鹰以进行存储→这样可以防止EtOH蒸发!
  • 地点 LMD 滑下10分钟 紫外线-C灯→活化膜,以获得更好的切片附着力并消毒表面!
  • 地点 0.2 or 0.5 毫升管s with lid open under 紫外线-C灯至少30 分钟→消毒并消除任何RNA& RNase!
  • 准备三个50 ml的Falcon管,并在圆锥形杯中放入一些硅胶袋→硅胶将使玻片和切片保持干燥,使用RNA意味着湿度和水分是您的敌人,因为它们可以激活RNase!

Cryosectioning

直接从–80将带有冷冻样品的块直接放入Leica低温恒温器 °C并使其平衡至少30 min at –19 °C.

平衡后,准备适当厚度的切片(应根据目标细胞的直径选择厚度,对于该测试10 准备了微米切片)。

将一个(卷曲的)切片从冷冻器直接放入0.5 毫升管,并立即添加350 µl RLT缓冲液(Qiagen的含量 Micro RNeasy 套件)。这将成为质量和数量的积极控制。

图4:卷曲的切片用冷镊子收集并直接转移到无菌管帽中。 350 立即加入µl RLT缓冲液以保护RNA免受降解。

图5:准备切片并将其安装在PEN框架滑轨上。冷冻部分很容易融化到室温下的膜上。

将载有该部分的幻灯片放进75英寸的猎鹰中 -20%的乙醇溶液 °C for 2 分钟(简短注视)。 2之后 至少短暂风干载玻片并将其保存在50 ml Falcon,并在圆锥形杯中放入一些硅胶袋(以保持干燥)。

用另一部分重复此安装并滑动,但要添加一些液滴而不是储存1 %甲酚紫溶液用注射器通过无菌过滤嘴。将染色液留在切片上1 分钟然后,将幻灯片短暂浸入75中,以洗去甲酚紫 % EtOH, then 95 %乙醇,最后100 %EtOH。短暂风干载玻片并将其保存在50 ml Falcon,并在圆锥形杯中放入一些硅胶袋(以保持干燥)。

在另一部分重复整个过程,然后滑动。

图6:使用注射器将甲酚紫通过无菌过滤器覆盖在载玻片上的切片上,用于1 min.

图7:染色后的洗涤步骤:将载玻片浸入上升的EtOH行中,以洗净残留的甲苯酚紫。

重要的提示:

  • 将载玻片保存在Falcon管中,并在圆锥形容器中放置一些硅胶袋,然后用Parafilm将其密封→硅胶将保持载玻片和切片干燥,密封可防止环境湿气!

将所有试管和猎鹰与幻灯片一起存放在冰上。让幻灯片平衡15 分钟,在室温下 LMD 使用之前,请将系统密封在Falcon中。

LMD test slides

您现在应该拥有:

  • 装有350 µl RLT缓冲液的管中的1个部分(阳性对照)
  • 1个部分安装在幻灯片上,并用50倍的EtOH固定 毫升猎鹰,硅胶袋
  • 2张载有EtOH固定并用CV染色的切片的载玻片,保存在50中 毫升猎鹰,硅胶袋

图8:Falcons和75中的缓冲液,试管,载玻片 在冰上的冰箱中加入%的乙醇。

带有未染色部分的幻灯片用作另一个控件。因此,用RLT缓冲液直接从膜中消化,然后将其转移至0.5 ml管(RLT缓冲液总量必须为350 µl,请勿将其全部用于从玻片上消化,因为它将冲洗掉玻片!)。

固定和染色的载玻片之一用作另一个对照。因此,使用RLT缓冲液直接从膜中消化切片,并将其转移到0.5 ml试管中(RLT缓冲液的总量必须为350 µl,请勿将其全部用于从玻片上消化,因为它将冲洗掉玻片!)。

徕卡LMD系统用于RNA分析

剩余的固定和染色的载玻片适用于 LMD。因此,将载玻片装入样品架并装入0.5 ml管在收集支架中。选择加载的收集器的位置,并用 LMD 软件,使用所需的放大倍率。启动激光器,并在解剖后检查所有切片均已收集在收集管中。如有必要,请使用Move + Cut剪切该部分,以确保收集了所有部分。

Unload the collection tube, carefully close the lid and briefly spin down the dissectates. Open the lid and add 350 µl RLT缓冲液(最大65 可在切割前将µl RLT缓冲液添加到收集帽中。

图9:将带有固定和染色部分的PEN框架滑轨加载到 LMD 系统。

装上另一个收集帽,并在收集切片的区域(大约相同的面积,以µm²为单位)附近解剖空膜。卸下收集管,小心地关闭盖子,并短暂地旋转分解物。打开盖子并添加350 µl RLT缓冲液(最大65  该管将用作 LMD 负面控制稍后。

图10:将切片以选定的放大倍率解剖成无菌的管帽。

图11:标记的区域和解剖结果易于观察:左=切割线,中=解剖区域,右=在收集管盖中解剖。

重要的提示:

  • 最多可将65 µl RLT缓冲液直接加到收集管盖上,以保护捕获后的分解物含量不被降解。

图12:肉眼也可以看到低倍放大的解剖物(使用5倍物镜实现的解剖物示例)。

激光显微切割下游的制备和加工

  • 在装有RPE的瓶子中添加44毫升,并选中复选框以确保添加了EtOH。
  • 准备70的溶液 % EtOH: add 35 ml 100 % EtOH to a 50 ml Falcon and add 15 ml分子生物学级水。
  • 准备80的溶液 % EtOH: add 40 ml 100 % EtOH to a 50 ml Falcon and add 10 ml分子生物学级水。

图13:使用Qiagen RNeasy进行RNA提取的略微修改的方案® 微 kit was used.

Extract 核糖核酸 using the Qiagen 微 kit with the following slightly modified protocol:

  1. 准备好所有试管。

  1. 向每支试管中加入350 70微升%乙醇(如有必要,在加入350升另一支合适体积的试管中 µl 70 %EtOH),小心地与移液器混合,然后直接转移到红色旋转柱中。

重要的提示:

350 µl应分为100和250 µl,以免超过0.5的体积 毫升管。混合可以直接在色谱柱上进行。

  1. 以10,000 rpm旋转15秒。

图14:将缓冲液应用于Qiagen RNeasy® 旋转柱。

  1. 丢弃流通液,并向洗涤柱中加入350 µl RW1
  2. 以10,000 rpm旋转15秒。

图15:离心机中的色谱柱已准备就绪。

  1. Discard the flow-through, place the column in a fresh 2 毫升管 and add 500 µl RPE(之前添加了EtOH)以洗涤色谱柱
  2. 以10,000 rpm旋转15秒。
  3. 丢弃流通液并添加500 µl 80 洗涤柱的%EtOH
  4. 以13,000 rpm旋转2分钟
  5. 丢弃流通液,然后将色谱柱放到新的色谱柱中2 ml tube
  6. 最大旋转5分钟速度和盖子打开以干燥色谱柱的硅胶膜
  7. 用14 µl水中洗脱:小心吸移14 将微升无RNAse的水注入柱膜的中间,并将柱置于新鲜的标有1.5的柱中 ml tube

图16:将14 µl不含RNase的水轻轻倒入色谱柱中间,以洗脱提取的RNA。

  1. 以13,000 rpm旋转1分钟
  2. 小心地将流通液吸回色谱柱膜的中间
  3. 以13,000 rpm旋转2分钟

洗脱液应储存在–80 °C或在可能的情况下立即用于质量和数量评估。

简要协议摘要

样品:

A –直接从冷冻样品中取样(总体阳性对照)
B –固定样品,用移液器拾取(阳性对照,EtOH固定作用)
C –固定并染色的样品,用移液管拾取(阳性对照,EtOH固定和染色的效果)
D –固定并染色的样品,由 LMD (的影响 LMD)
E –样品旁边收集的空膜(负控制 LMD 过程/污染物)
F – RLT缓冲液对下游纯化的阴性控制

核糖核酸 extracted with Qiagen 微 kit:

  1. 添加350 µl RLT缓冲液
  2. Add 350 70微升 %乙醇,与移液器混合并直接转移至色谱柱
  3. 旋转15 s,10,000 rpm
  4. 丢弃流通液并用350 µl RW1冲洗
  5. 旋转15 s,10,000 rpm
  6. 丢弃流通液,并用500 µl RPE(之前添加EtOH)洗涤
  7. 旋转15 s,10,000 rpm
  8. 丢弃流通 and wash with 500 80微升% EtOH
  9. 旋转2分钟,10,000 rpm
  10. 丢弃流通
  11. 最多旋转2分钟打开盖子干燥膜的速度
  12. 在14 µl水中洗脱*
  13. 旋转1分钟,全速
  14. 使用洗脱液并将其放回色谱柱中
  15. 旋转1分钟,全速

Results

RIN®28S / 18S
(高度)
28S / 18S
(区)
浓缩
(ng / µl)
样品
描述
警报观察结果总RNA面积rRNA面积
A0137阶梯
A17.41.41.969.1A2.790.61
B17.11.31.984.5B3.410.76
C17.31.42.0127C5.131.26
D17.21.02.083.6D3.380.78
E16.50.40.4110E4.440.98
D96.90.70.967.3D2.680.59
C27.36K!核糖核酸浓度超出RINe的建议范围0.30
D26.57L!核糖核酸浓度超出RINe的建议范围0.27
样品名称材料日期时间A260浓度(ng / ul)A260(10毫米)A280(10毫米)A260 / A280A260 / A230
blank_6核糖核酸11.12.2014######000
A核糖核酸11.12.2014######32.420.810.411.980.13
B核糖核酸11.12.2014######48.181.20.582.070.1
C核糖核酸11.12.2014######71.011.780.8921.51
D核糖核酸11.12.2014######48.321.210.542.240.03
E核糖核酸11.12.2014######64.651.620.732.20.06
D核糖核酸10.12.2014######41.791.040.472.230.03
K核糖核酸11.12.2014######1.720.040.021.970.02
L核糖核酸11.12.2014######0.740.020.012.910.02

Quality

经过不同处理的所有样品(AD)的质量几乎都相同(RIN 7.1–7.4)。对EtOH固定,染色和徕卡无影响 LMD 解剖可检测。

在Parafilm密封的50中低温保存玻片 ml Falcon tube at–80 °C过夜,逐步解冻20 min in –20 °C freezer, 20 min in 4 °C fridge and 15 在重新打开Falcon管之前,在室温下放置3分钟,在徕卡之后获得了可比的结果 LMD 解剖(样本E1&D9,RIN 6.9和6.5)。

所有阴性对照均为空。

Quantity

所有经过不同处理的样品(AD)的数量几乎相同,只有样品C(直接从载玻片固定,染色和挑选)显示出比阳性对照(样品A)更高的数量。不受EtOH固着,染色或Leica的影响 LMD 解剖可检测。

在Parafilm密封的50中低温保存玻片 毫升猎鹰管–80 °C过夜,逐步解冻20 min in –20 °C freezer, 20 min in 4 °C fridge and 15 在重新打开Falcon管之前,在室温下放置3分钟,在徕卡之后获得了可比的结果 LMD 以及解剖(样品E1和D9,储存后的量略高)。

所有阴性对照均为空。

不同的测量方法导致不同的结果→常见的测量误差。

总之,这些数据清楚地表明工作流程不会影响RNA的质量或数量。

Acknowledgement

我想要感谢 伦道夫·哈贝克博士 用于托管 LMD 作坊。